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土壤DNA提取
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提取土壤总DNA： 方法：1.称取样品土样5g,加入灭菌的石英砂，液氮研磨； 2.加入13.5mL的DNA提取Buffer，100微升20mg/mL蛋白酶K，37℃225rpm摇2h； 3.加入700微升20%SDS，65℃水浴2h,间隔15min颠倒摇匀数次； 4.6000rpm室温离心15min,收集中间液相层；向沉淀中加入3mLDNA提取液，300微升20%SDS，65℃水浴30min，同上离心，收集中间液相层，合并；重复一次； 5.向收集的液相层中加入等体积氯仿：异戊醇（24：1）抽提一次，8000rpm离心10min，收集上部液相层； 6.第5步收集液相层中加入0.1倍体积的乙酸钠，0.6倍体积的异丙醇，4℃过夜沉淀； 7.过夜沉淀物12000rpm离心15min，弃上清；向沉淀中加入10mL冷乙醇洗涤，12000rpm离心5min，弃上清；12000rpm离心30sec，移液枪析出残留液体； 8.室温自然干燥沉淀，干燥后向沉淀中加入400微升TE溶解。 土样比较特殊，黑色，腐殖质等物质含量高，提了三次，每次电泳仅见色素很亮，无DNA，PCR扩增也无目的片段，请各位大侠帮忙诊断诊断！ DNA提取液组成：100mM Tris，100mMEDTA，200mMNaCl，2%PVPP，3%CTAB，pH9.0 以上为三次提取的详细过程及试剂用量。 [ Last edited by hbxjh1984 on 2009-6-18 at 17:44 ] |
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直接提DNA的目的分析多样性，虽然方法不是建库，但是要求尽量都提出环境总DNA。我前面用同样的方法提取同样环境的DNA，已经完成了克隆文库的构建及分析，这次是新采集的样品，做一些新东西，需要DNA的量大，质量好，片段>23kb就行了。根据前三次提取的过程表现看，和以前没有什么不同，第一次室温离心上层有大量的蛋白，破壁等应该完全了......真搞不懂！上周提的两次我都用TENP缓冲液、PBS缓冲液洗了，也没提出来。郁闷ing
9楼2009-06-19 12:42:37
weilin2378
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土壤DNA的提取可以参照Zhou的方法（DNA recovery from soils of diverse composition，Appl. Environ. Microbiol.，1996，62，316-322）. 提取后DNA的纯化可参考Jackson的方法（A simple, efficient method for the separation of humic substances and DNA from environmental samples，Appl. Environ. Microbiol.，1997，63，4993-4995）。 另外还可以购买试剂盒。我用过SoilMaster DNA Extraction Kit (Epicenter) 和UltraClean Soil DNA Isolation Kit (MO BIO), 都不错。 |
3楼2009-06-18 20:22:15
4楼2009-06-18 20:25:58
weilin2378
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