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w.king124
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好奇怪，没有左臂和右臂的质粒能让目的基因在真核细胞中稳定表达吗
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本人现在正将目的基因（1KB）与载体大片段（11kb）进行连接，连了四个多月了，一直没有结果，十分的沮丧  由于当初一直找不到合适的载体，就选择了Xho1单酶切（老板告诉以后的连接可能会麻烦点），设计引物时目的基因的两端也是加了该位点，刚开始直接连时，出的菌斑全是假阳性（耗掉了2个月），后来载体做了5‘去磷酸化，也是一直没连上，根本没有出现菌斑，处于崩溃的边缘  马上都研三了！！！！！上几天偶尔发现一篇文章，是做杜氏盐藻（一种单细胞真核生物，我也是做这个的）表达载体的，他们是在pUC18—T载体的基础上，加入了启动子，目的基因，终止子和一个筛选标记基因，构建完毕后转入盐藻，多代筛选后，提RNA，做RT-PCR，结果在盐藻中稳定表达，现在我也想这么做做试试，虽然风险很大，但是没有其他的退路了  不过我有一点疑问，一个克隆载体加入启动子、终止子会让目的基因表达，但是没有左右臂，转进真核细胞后目的基因会整合到基因组中吗？或者会稳定表达吗？ 希望大家献计献策啊 附上该文章 http://www.namipan.com/d/%E6%9D% ... 4f2e092032685ce1400 [ Last edited by w.king124 on 2009-6-16 at 13:37 ] |
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