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w.king124
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好奇怪，没有左臂和右臂的质粒能让目的基因在真核细胞中稳定表达吗
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本人现在正将目的基因（1KB）与载体大片段（11kb）进行连接，连了四个多月了，一直没有结果，十分的沮丧  由于当初一直找不到合适的载体，就选择了Xho1单酶切（老板告诉以后的连接可能会麻烦点），设计引物时目的基因的两端也是加了该位点，刚开始直接连时，出的菌斑全是假阳性（耗掉了2个月），后来载体做了5‘去磷酸化，也是一直没连上，根本没有出现菌斑，处于崩溃的边缘  马上都研三了！！！！！上几天偶尔发现一篇文章，是做杜氏盐藻（一种单细胞真核生物，我也是做这个的）表达载体的，他们是在pUC18—T载体的基础上，加入了启动子，目的基因，终止子和一个筛选标记基因，构建完毕后转入盐藻，多代筛选后，提RNA，做RT-PCR，结果在盐藻中稳定表达，现在我也想这么做做试试，虽然风险很大，但是没有其他的退路了  不过我有一点疑问，一个克隆载体加入启动子、终止子会让目的基因表达，但是没有左右臂，转进真核细胞后目的基因会整合到基因组中吗？或者会稳定表达吗？ 希望大家献计献策啊 附上该文章 http://www.namipan.com/d/%E6%9D% ... 4f2e092032685ce1400 [ Last edited by w.king124 on 2009-6-16 at 13:37 ] |
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w.king124 
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w.king124(金币+4,VIP+0):你这个是双酶切，比较好连，呵呵，我那个还得去磷酸化，再者我的载体比较大，可能也有很大关系，谢谢你的建议了，呵呵 6-17 20:02
w.king124(金币+4,VIP+0):你这个是双酶切，比较好连，呵呵，我那个还得去磷酸化，再者我的载体比较大，可能也有很大关系，谢谢你的建议了，呵呵 6-17 20:02
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我当时做链接的时候用的酶切位点是Nde1和Xho1，我的连接条件是16度过夜连接，然后用自己做的DH5a感受态去做转化，最终长出了一个菌斑，后来PCR，酶切验证就是重组子。 我的体系是：3微升载体片(5.2kb) 5微升目的基因（0.9kb） 1微升buffer 约大于1微升ligase。 注：我没有测定DNA的浓度，不过我的酶切片段都很亮，我用的内切酶和ligase是宝生物的。 后来把体系变了一下： 6微升载体片(5.2kb) 3微升目的基因（0.9kb） 1.2微升buffer 1.2微升ligase。 干脆连了24个小时。这次长了很多菌斑。而且基本上都是。 注：做的时候连接时间太长，注意做一下载体自连实验，那样可以知道大体假阳性的比例是多少。 祝你顺利！！！ |
6楼2009-06-17 08:34:11
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