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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助 Pfu酶PCR
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xj22667

银虫 (小有名气)

[交流] 求助 Pfu酶PCR

我在用PCR扩增长约280bp的片段时，用Taq酶可以扩增出，但同样的体系和条件用Pfu酶却扩增不出目的片段，请问各位大侠这是什么原因？
由于我要克隆并表达这基因，且Taq酶的出错率较高，所以我一直不敢做下去，我该怎么办啊，救救我啊！

[ Last edited by xj22667 on 2009-6-12 at 13:55 ]
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1楼 2009-06-12 13:54:17
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lynn5180

铜虫 (初入文坛)
★
sxdxrhyy(金币+1,VIP+0):谢谢参与讨论！ 7-27 10:21
280bp就大胆的用rTAQ吧，然后多送几个测序，TAQ的突变率大概在千分之几
大不了用KOD不可能整不出来的
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2楼2009-06-12 14:03:25
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
才280bp……无所谓的……只要控制循环数
Pfu的扩增能力是差点，需要降低点退火并且延长聚合时间
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3楼2009-06-12 14:07:03
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xj22667

银虫 (小有名气)
上下游引物Tm值都是60度 我设的梯度60度 1min  58度1min 56度1min都扩不出来
应该怎么修改啊
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4楼2009-06-12 14:12:03
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xmchen1015

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
试一下53C 30s; 72C 40s ,如果不行再降一下温度
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5楼2009-06-12 14:41:52
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xj22667

银虫 (小有名气)
谢谢 我去试试
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6楼2009-06-12 15:14:34
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njlf1258

确实仅280bp用一般的Taq就可以了，pfu酶扩增效率要大概低50%。
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7楼2009-06-12 15:56:45
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
很多pfu的温度都是68度吧
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8楼2009-06-12 15:59:00
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xj22667

银虫 (小有名气)
让我犹豫没往下做是因为用Taq酶我做的阴性对照（用水代替模板）都能扩得出来
所以我觉的结果不可信啊
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9楼2009-06-12 16:13:23
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zzm7806

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
用rTaq不放心就用ExTaq试试，我扩1400bp的，用ExTaq，测序没有任何问题！
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10楼2009-06-12 17:00:50
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