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nanjixing000

银虫 (小有名气)

[交流] 如何增加PCR特异性

最近用TAKARA的TAQ酶做PCR时总是条带特异性特别差,本该是一个条带的泳道上往往出现很多条带,自己也尝试了一些方式进行优化,但效果不明显。
    请教有经验的虫友,从哪些方面可有效地提高PCR的特异性?

[ Last edited by amisking on 2009-6-12 at 07:59 ]
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iaminxanadu

木虫 (正式写手)


nanjixing000(金币+1):谢谢参与
要看你的非特异性条带是大了还是小了,采取不同方法。
如果大小都有可以试试减少模板,减少酶量,减少引物,增加退火温度等方法。
5楼2009-06-12 00:09:56
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)


nanjixing000(金币+1):谢谢参与
好好设计引物,要不然就换酶,最简单的了
Invitrogen的AccuPrimer,似乎是这么拼写……
2楼2009-06-11 23:05:22
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lifeip

至尊木虫 (知名作家)


nanjixing000(金币+1):谢谢参与
如楼上所说,换酶!
3楼2009-06-11 23:09:12
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huangdi5217

铁杆木虫 (正式写手)


nanjixing000(金币+1):谢谢参与
引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5μM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。另外,细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。还有就是退火温度,退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火,同时还要足够高,以减少非特异性结合。
4楼2009-06-12 00:01:05
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