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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 如何增加PCR特异性
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nanjixing000

银虫 (小有名气)

[交流] 如何增加PCR特异性

最近用TAKARA的TAQ酶做PCR时总是条带特异性特别差，本该是一个条带的泳道上往往出现很多条带，自己也尝试了一些方式进行优化，但效果不明显。
    请教有经验的虫友，从哪些方面可有效地提高PCR的特异性？

[ Last edited by amisking on 2009-6-12 at 07:59 ]
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1楼 2009-06-11 23:00:23
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
nanjixing000(金币+1):谢谢参与
好好设计引物，要不然就换酶，最简单的了
Invitrogen的AccuPrimer，似乎是这么拼写……
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2楼2009-06-11 23:05:22
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lifeip

至尊木虫 (知名作家)
★
nanjixing000(金币+1):谢谢参与
如楼上所说，换酶！
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3楼2009-06-11 23:09:12
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huangdi5217

铁杆木虫 (正式写手)
★
nanjixing000(金币+1):谢谢参与
引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5μM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。另外，细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。还有就是退火温度，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。
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4楼2009-06-12 00:01:05
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iaminxanadu

木虫 (正式写手)
★
nanjixing000(金币+1):谢谢参与
要看你的非特异性条带是大了还是小了，采取不同方法。
如果大小都有可以试试减少模板，减少酶量，减少引物，增加退火温度等方法。
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5楼2009-06-12 00:09:56
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xyhua1984

银虫 (小有名气)
★
nanjixing000(金币+1):谢谢参与
可能是你引物设计的不是很好,或者退火温度再摸索一下
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6楼2009-06-12 00:13:55
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dyyyyy

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
退火温度。是否引入突变，如果是，开始温度应该低一些。
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7楼2009-06-12 07:03:31
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欣晴5832

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
这就要优化一下你的体系和反应程序了，优化的时候可以用别的酶先试一试。
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8楼2009-06-12 07:53:15
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xj22667

银虫 (小有名气)
建议换pfu酶试一下
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9楼2009-06-12 08:17:08
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350784478

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我想说的，都让楼上的说完了，你可以参考一下，最主要的是退火温度，温度对了，一般是没有什么问题的，我一开始也是这样，后来把温度降下来，就没有杂带了。
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朝为田舍郎，暮登天子堂。将相本无种，男儿当自强。
10楼2009-06-12 08:58:51
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