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nanjixing000

银虫 (小有名气)

[交流] 如何增加PCR特异性

最近用TAKARA的TAQ酶做PCR时总是条带特异性特别差,本该是一个条带的泳道上往往出现很多条带,自己也尝试了一些方式进行优化,但效果不明显。
    请教有经验的虫友,从哪些方面可有效地提高PCR的特异性?

[ Last edited by amisking on 2009-6-12 at 07:59 ]
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nanjixing000

银虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2009-6-11 23:05:
好好设计引物,要不然就换酶,最简单的了
Invitrogen的AccuPrimer,似乎是这么拼写……

因为是从质粒上P插入片段,所以我的引物是质粒序列,而且是实际盒提供我重新合成的,应该不是引物问题。不过换酶应该是个好建议
13楼2009-06-12 09:25:41
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)


nanjixing000(金币+1):谢谢参与
好好设计引物,要不然就换酶,最简单的了
Invitrogen的AccuPrimer,似乎是这么拼写……
2楼2009-06-11 23:05:22
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lifeip

至尊木虫 (知名作家)


nanjixing000(金币+1):谢谢参与
如楼上所说,换酶!
3楼2009-06-11 23:09:12
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huangdi5217

铁杆木虫 (正式写手)


nanjixing000(金币+1):谢谢参与
引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5μM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。另外,细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。还有就是退火温度,退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火,同时还要足够高,以减少非特异性结合。
4楼2009-06-12 00:01:05
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