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liusu05

铁虫 (初入文坛)

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[交流] 数字PCR技术复杂生物样本中DNA/RNA绝对定量的解决方案已有1人参与

数字PCR技术：dPCR和qPCR(Real-time PCR)技术定量检测DNA/RNA时抑制剂的影响对比
众所周知，数以千种的化学物质会抑制PCR反应有作用，而生物样本往往都会含有类似的化合物，在DNA/RNA纯化时，这类化合物很难去除，所以会存在DNA/RNA样本中。

数字PCR技术： qPCR和Crystal dPCR进行DNA/RNA定量的比较
qPCR (Real-time PCR)进行DNA/RNA定量时，基于Ct值，且依赖于分析的样品和标准品之间的标准曲线，通过未知样品与含有已知量核酸标准品之间的Ct值得到未知样品的浓度。但当样品中存在抑制剂时，标准品和样品之间由于背景不同，所以PCR反应效率可能不同，因此定量结果将会有偏差（图1A）。
Naica crystal dPCR进行DNA/RNA定量时，结果判读在于通过荧光值区分微滴的阳性或阴性。即使有因抑制剂存在而导致PCR反应效率降低，仍然可以实现准确定量（图1B）。
数字PCR技术：qPCR和Crystal dPCR对抑制剂的耐受性比较
我们在qPCR和Crystal dPCR平台比较了存在两种在样品中发现的已知抑制剂对DNA定量分析的影响，分别是在土壤样本中存在的腐殖酸和在收集的血样中用作抗凝血剂的肝素。结果显示，与qPCR相比，Crystal dPCR在任何较高浓度抑制剂存在的情况下，仍然可以进行准确定量（图3）。
数字PCR技术：qPCR和Crystal dPCR反应包含PerfeCta Multiplex qPCR Toughmix，相同量的人类基因组DNA，以及测试腐殖酸抑制作用的靶向BRAF基因和测试肝素抑制作用的EGRF基因的引物和探针。所有样品进行2次实验，每次实验三个重复（利用Sigmoid即S型函数拟合）。以不添加抑制剂的DNA定量为0％抑制，计算抑制百分比。

综上所述，当对存在抑制剂的样品进行DNA/RNA分析时，Crystal dPCR可以比qPCR的结果更为可靠。Crystal dPCR是您一直在寻找的针对含抑制剂样本中核酸检测和定量的最佳解决方案。

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