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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 请问RT-PCR中一个步骤的作用
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YangLryyc

铜虫 (小有名气)

[交流] 请问RT-PCR中一个步骤的作用

请问一下protocol中，第4步在室温放置2min和第5步25℃孵育10min的目的是什么？
Reverse Transcription is carried out with the SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR. The following procedure is based on Invitrogen’s protocol.

1. Prepare the following RNA/primer mixture in each tube:

Total RNA 5 mg
random hexamers (50 ng/ml)  3 ml
10 mM dNTP mix 1 ml
DEPC H2O  to 10 ml

2. Incubate the samples at 65°C for 5 min and then on ice for at least 1 min.
3. Prepare reaction master mixture. For each reaction:

10x RT buffer 2 ml
25 mM MgCl2  4 ml
0.1 M DTT 2 ml
RNAaseOUT 1 ml

4. Add the reaction mixture to the RNA/primer mixture, mix briefly, and then place at room temperature for 2 min.
5. Add 1 ml (50 units) of SuperScript II RT to each tube, mix and incubate at 25°C for 10 min.
6. Incubate the tubes at 42°C for 50 min, heat inactivate at 70°C for 15 min, and then chill on ice.
7. Add 1 ml RNase H and incubate at 37°C for 20 min.
8. Store the 1st strand cDNA at -20°C until use for real-time PCR.

[ Last edited by 350784478 on 2009-8-17 at 17:14 ]
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1楼 2009-06-06 23:35:08
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YangLryyc

铜虫 (小有名气)
那么第2步中的65℃，5min又是作什么？立即冰浴的作用呢？
请高手指教，我是菜鸟：——）

[ Last edited by YangLryyc on 2009-6-7 at 00:24 ]
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3楼2009-06-06 23:57:41
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你是用随机引物？
随机引物才6个碱基，这里相当于退火
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2楼2009-06-06 23:43:23
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whllzm

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
第2步中的65℃，5min和冰水浴是为了使引物和模板正确配对
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2009-06-07 00:14:03
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
以及解开模板的二级结构
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2009-06-07 00:20:46
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