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请问RT-PCR中一个步骤的作用
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请问一下protocol中，第4步在室温放置2min和第5步25℃孵育10min的目的是什么？ Reverse Transcription is carried out with the SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR. The following procedure is based on Invitrogen’s protocol. 1. Prepare the following RNA/primer mixture in each tube: Total RNA 5 mg random hexamers (50 ng/ml) 3 ml 10 mM dNTP mix 1 ml DEPC H2O to 10 ml 2. Incubate the samples at 65°C for 5 min and then on ice for at least 1 min. 3. Prepare reaction master mixture. For each reaction: 10x RT buffer 2 ml 25 mM MgCl2 4 ml 0.1 M DTT 2 ml RNAaseOUT 1 ml 4. Add the reaction mixture to the RNA/primer mixture, mix briefly, and then place at room temperature for 2 min. 5. Add 1 ml (50 units) of SuperScript II RT to each tube, mix and incubate at 25°C for 10 min. 6. Incubate the tubes at 42°C for 50 min, heat inactivate at 70°C for 15 min, and then chill on ice. 7. Add 1 ml RNase H and incubate at 37°C for 20 min. 8. Store the 1st strand cDNA at -20°C until use for real-time PCR. [ Last edited by 350784478 on 2009-8-17 at 17:14 ] |
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