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lren_87铁杆木虫 (正式写手)
傻子乐
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[求助]
蛋白提取SDS-PAGE，条带总是很弱已有1人参与
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最近一直跑sds-page，maker相对很清晰，但是蛋白条带很弱，不知道什么原因，结果见图，我补充下具体情况。 计划用磁珠法回收his标记的蛋白，所以缓冲液用的试剂盒推荐的缓冲液。 超声破碎提取的，破碎的比例是0.1g菌体：1mL缓冲液，在缓冲液的基础上加了少量巯基乙醇和曲拉通。 破碎效果挺好，浑浊变澄清，破碎后12000rpm离心10min，随后取上清加入1μL的DNase处理30min。 跑胶标准流程，12.5%，100v先跑，随后80v稳定到结束。 奈何一直都是条带很弱，求助前辈们指条路。  微信图片_20191023235914.jpg |
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楼主你好，你这个buffer有点奇怪呀。首先，曲拉通是什么？Triton嘛？如果是的话，为什么要在SDS-PAGE里加这种非离子性去垢剂呢？加了SDS，样品全部变性了呀。 发自小木虫Android客户端 |
12楼2019-11-01 07:45:11
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还有，你超声破碎过程中有没有加蛋白酶抑制剂？并且，超声的时候样品还得保持低温。否则，蛋白质会降解。超声之前有没有测量菌液的OD600？0.1g菌液比1 ml缓冲液并不能说明菌液浓度。如果是你加菌都条带很弱，应该考虑优化蛋白质表达的条件。包括温度，转速和培养时间的长短等。 发自小木虫Android客户端 |
13楼2019-11-01 07:52:09
15楼2019-11-04 04:58:47
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