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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » TA克隆一直失败，我将我的操作现在写下来，让大家分析分析问题
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ckck123456

新虫 (初入文坛)

[交流] TA克隆一直失败，我将我的操作现在写下来，让大家分析分析问题

首先是PCR，之后对PCR产物切胶回收，浓度比较低，但也是有明显条带的，看亮度是100ng/ul左右，之后加A反应，我在操作过程中在冰盒上完全溶解后放在4度的条件下，之后取样进行的实验，连接反应同样如此，条件都是没问题的，都是固定的步骤，转化的时候我在冰盒上溶解感受态到碎冰妆做的，之后严格按步骤进行，该混合的时候也混合了，涂布时，混匀，吸取200ul涂布，每个板上取了5 个白色单菌落，可是都是空载，到底什么问题，我的基因GC含量比较高，TA克隆是不是都该做出来，是我傻才做不出来？求指点，可以问更具体的

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1楼 2019-09-26 09:56:26
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安静de执着14

新虫 (著名写手)
★ ★ ★
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ckck123456: 金币+1 2019-09-26 14:24:57
myprayer: 金币+1, 应助指数+1, 赠人玫瑰，手有余香，鼓励积极发帖交流互帮互助。 2019-09-26 18:14:31
转化完培养后，离心去掉大部分上清，把所有的菌液进行涂布；把平板上长出的单菌落都挑出来进行PCR验证，如果你操作没错的话，就算空载体多，肯定会有重组载体的。如果空载体真的特别多，那么你在酶切载体的时候，就需要适量增加酶量或者延长酶切时间。

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4楼2019-09-26 11:49:06
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xipha

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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ckck123456: 金币+1 2019-09-26 14:24:00
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注意事项

1. 在进行克隆时，Vector DNA和Insert DNA的摩尔比一般为：1: 2～10。在本制品中，pMD18-T Vector 1 μl (50 ng) 的摩尔数约为0.03 pmol，Control Insert DNA 1μl (50 ng) 的摩尔数约为0.15 pmol。

2. 克隆时使用的Insert DNA片段 (PCR 产物) 尽量进行切胶回收纯化，PCR产物中的短片段

DNA(甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段)、残存引物等杂质都会影响TA克隆的效率。

3. 按照本实验操作进行连接后，直接进行转化时的连接液不要超过20 μl。

4. 连接反应请在16℃下进行，温度升高 (>26℃) 较难形成环状DNA。

5. 连接效率偏低时，可适当延长连接时间至数小时。

6. 当进行转化的DNA用量较大或准备进行电转化时，需对连接液进行乙醇沉淀精制DNA后再进行转化。
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2楼2019-09-26 10:04:54
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可爱宝宝

新虫 (正式写手)
★
ckck123456: 金币+1 2019-09-26 14:18:12
比例不对

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3楼2019-09-26 11:32:55
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woshishui916

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，鼓励积极发帖交流互帮互助。 2019-09-26 18:14:38
ckck123456: 金币+1 2019-09-26 18:44:53
加A之后得纯化的，要不直接连，空载很多的

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5楼2019-09-26 14:43:38
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