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金虫 (小有名气)

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[求助] 关于PCR产物直接进行的平末端连接问题已有1人参与

请问大家，kod，pfu等高保真聚合酶扩增的片段为平末端，能否直接连接到使用平末端内切酶切开的载体上？

还有下面几个问题请教大家：
1. T4 DNA聚合酶可以连接内切酶切口3'-OH和5'-P，该5'-P为一个磷酸。而PCR扩增产物5'端有3个P，这样能不能和载体上的3'-OH连接上。
2. 我看了一些资料上平末端连接需要载体去磷酸化，并且插入片段要进行磷酸化，请问插入片段的磷酸化是不是必要的，因为磷酸化的相对成本比较高。

问题有点长，麻烦各位耐心阅读。谢谢。

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1楼 2019-09-25 18:28:28

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wadecao

禁虫 (正式写手)

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2楼2019-09-25 22:27:37

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woshishui916

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需要纯化一下的

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3楼2019-09-26 00:12:50

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银虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

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洛洛洛洛洛果: 金币+5, ★★★很有帮助 2019-09-28 10:14:37

高保真聚合酶PCR产物可以连接平端载体。
天然的质粒都是磷酸化的，所以自制载体时最好去磷酸化一下，目的是为了防止载体自连。目的片段磷酸化，目的也是为了连接效率更高，但此步骤不是必要的。
正常我们做连接，都是PCR产物纯化后，按一定比例连载体。另外T4 DNA连接酶连接时间比较长，我们实验室现在用的都是TOPO载体，速度快阳性率高，楼主可以自行了解下。