应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 关于PCR产物直接进行的平末端连接问题
51/1返回列表
查看: 4778  |  回复: 4
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

洛洛洛洛洛果

金虫 (小有名气)

[求助] 关于PCR产物直接进行的平末端连接问题 已有1人参与

请问大家，kod，pfu等高保真聚合酶扩增的片段为平末端，能否直接连接到使用平末端内切酶切开的载体上？

还有下面几个问题请教大家：
1. T4 DNA聚合酶可以连接内切酶切口3'-OH和5'-P，该5'-P为一个磷酸。而PCR扩增产物5'端有3个P，这样能不能和载体上的3'-OH连接上。
2. 我看了一些资料上平末端连接需要载体去磷酸化，并且插入片段要进行磷酸化，请问插入片段的磷酸化是不是必要的，因为磷酸化的相对成本比较高。

问题有点长，麻烦各位耐心阅读。谢谢。
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2019-09-25 18:28:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wadecao

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
2楼2019-09-25 22:27:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

woshishui916

木虫 (著名写手)
★
myprayer: 金币+1, 鼓励积极发帖交流，为分子生物版块的发展添砖加瓦。 2019-09-26 18:13:02
需要纯化一下的

发自小木虫Android客户端
回复此楼
3楼2019-09-26 00:12:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

965688871

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+3, 应助指数+1, 赠人玫瑰，手有余香，鼓励积极发帖交流互帮互助。 2019-09-26 18:12:37
洛洛洛洛洛果: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢 2019-09-26 20:04:00
洛洛洛洛洛果: 金币+5, ★★★很有帮助 2019-09-28 10:14:37
高保真聚合酶PCR产物可以连接平端载体。
天然的质粒都是磷酸化的，所以自制载体时最好去磷酸化一下，目的是为了防止载体自连。目的片段磷酸化，目的也是为了连接效率更高，但此步骤不是必要的。
正常我们做连接，都是PCR产物纯化后，按一定比例连载体。另外T4 DNA连接酶连接时间比较长，我们实验室现在用的都是TOPO载体，速度快阳性率高，楼主可以自行了解下。
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2019-09-26 09:50:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

JAYWEN书生

银虫 (小有名气)
载体单酶切会发生自连，最好双酶切。插入片段就不用去磷酸化了

扩增插入片段Proofast™ Max Super-Fidelity DNA Polymerase
还不错，我师姐在Science Advances发的文章就用这个。DOI: 10.1126/sciadv.aaw8451
赞一下 回复此楼
5楼2020-03-11 15:25:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 洛洛洛洛洛果 的主题更新
51/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 085600 英一数二272求调剂 5+6 vida_a 2026-03-01 36/1800 2026-03-03 14:05 by 13589
[考研] 085600材料与化工调剂 280分 +9 yyqqhh 2026-03-03 9/450 2026-03-03 13:53 by NUAAZXWS
[考研] 290求调剂 +7 ErMiao1020 2026-03-02 7/350 2026-03-03 13:49 by Iveryant
[考研] 化学0703求调剂 学硕 理/工科均可 总分279 +3 1一11 2026-03-03 5/250 2026-03-03 12:37 by 1一11
[考研] 中国科学技术大学材料与化工281求调剂，有科研和获奖经历 +6 wsxw 2026-03-02 7/350 2026-03-03 12:33 by lature00
[考研] 080500材料科学与工程 +4 202114020319 2026-03-03 4/200 2026-03-03 11:55 by ms629
[考研] 338求调剂 +5 18162027187 2026-03-02 6/300 2026-03-03 07:52 by njzyff
[考研] 298求调剂 +7 axyz3 2026-02-28 8/400 2026-03-03 06:11 by tgxtgxtgx9
[考研] 085602化学工程350，调剂，有没有211的 +5 利好利好. 2026-03-02 8/400 2026-03-03 00:30 by deng.z.1314
[考研] 295求调剂。一志愿报考郑州大学化学工艺学硕，总分295分 +8 yl1 2026-03-02 9/450 2026-03-02 21:21 by sunny81
[考研] 求调剂 +7 repeatt?t 2026-02-28 7/350 2026-03-02 20:34 by hypershenger
[考研] 0805总分292，求调剂 +10 幻想之殇 2026-03-01 10/500 2026-03-02 19:51 by zhukairuo
[考研] 一志愿东北大学化学314分求调剂 +3 lr1212.. 2026-03-02 3/150 2026-03-02 17:36 by yeahyou
[考研] 303求调剂 +5 今夏不夏 2026-03-01 5/250 2026-03-02 15:01 by 向上的胖东
[考研] 哈工大计算机刘劼团队招生 +4 hit_aiot 2026-03-01 6/300 2026-03-02 11:53 by 一声问好
[考研] 调剂 +3 13853210211 2026-03-02 4/200 2026-03-02 10:16 by 13853210211
[考研] 322求调剂 +3 熊境喆 2026-03-01 3/150 2026-03-02 08:44 by houyaoxu
[考研] 272求调剂 +6 田智友 2026-02-28 6/300 2026-03-01 21:40 by 公瑾逍遥
[考研] 化工299分求调剂 一志愿985落榜 +5 嘻嘻(*^ω^*) 2026-03-01 5/250 2026-03-01 19:47 by 无际的草原
[考研] 304求调剂 +3 52hz~~ 2026-02-28 5/250 2026-03-01 00:00 by 52hz~~
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭