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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 关于PCR产物直接进行的平末端连接问题
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洛洛洛洛洛果

金虫 (小有名气)

[求助] 关于PCR产物直接进行的平末端连接问题 已有1人参与

请问大家，kod，pfu等高保真聚合酶扩增的片段为平末端，能否直接连接到使用平末端内切酶切开的载体上？

还有下面几个问题请教大家：
1. T4 DNA聚合酶可以连接内切酶切口3'-OH和5'-P，该5'-P为一个磷酸。而PCR扩增产物5'端有3个P，这样能不能和载体上的3'-OH连接上。
2. 我看了一些资料上平末端连接需要载体去磷酸化，并且插入片段要进行磷酸化，请问插入片段的磷酸化是不是必要的，因为磷酸化的相对成本比较高。

问题有点长，麻烦各位耐心阅读。谢谢。
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1楼 2019-09-25 18:28:28
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wadecao

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
2楼2019-09-25 22:27:37
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woshishui916

木虫 (著名写手)
★
myprayer: 金币+1, 鼓励积极发帖交流，为分子生物版块的发展添砖加瓦。 2019-09-26 18:13:02
需要纯化一下的

发自小木虫Android客户端
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3楼2019-09-26 00:12:50
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965688871

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+3, 应助指数+1, 赠人玫瑰，手有余香，鼓励积极发帖交流互帮互助。 2019-09-26 18:12:37
洛洛洛洛洛果: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢 2019-09-26 20:04:00
洛洛洛洛洛果: 金币+5, ★★★很有帮助 2019-09-28 10:14:37
高保真聚合酶PCR产物可以连接平端载体。
天然的质粒都是磷酸化的，所以自制载体时最好去磷酸化一下，目的是为了防止载体自连。目的片段磷酸化，目的也是为了连接效率更高，但此步骤不是必要的。
正常我们做连接，都是PCR产物纯化后，按一定比例连载体。另外T4 DNA连接酶连接时间比较长，我们实验室现在用的都是TOPO载体，速度快阳性率高，楼主可以自行了解下。
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4楼2019-09-26 09:50:10
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JAYWEN书生

银虫 (小有名气)
载体单酶切会发生自连，最好双酶切。插入片段就不用去磷酸化了

扩增插入片段Proofast™ Max Super-Fidelity DNA Polymerase
还不错，我师姐在Science Advances发的文章就用这个。DOI: 10.1126/sciadv.aaw8451
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5楼2020-03-11 15:25:31
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