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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助】请教RTPCR达人试验成功率如何？
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wjswj

木虫 (正式写手)

小木虫领金币专业户

[交流] 【求助】请教RTPCR达人试验成功率如何？

如题，最近一直苦于用PCR来给基因组中的某基因进行相对定量，发现试验数据基本不靠谱，因试验原理与实时定量PCR有许多相似之处，故请教各位达人，RT-PCR试验的成功率如何，做多少次才能出一次像样的结果？
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金币是赌出来的
1楼 2009-06-04 10:19:32
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michaelwuqingyu

金虫 (正式写手)
你做的是 real time 还是普通RT？
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2楼2009-06-05 05:30:41
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Shengjing

铁虫 (初入文坛)
你应该指的是real time PCR吧。

这个很难说，看你的实验设计，要做的基因是什么。说的详细一点让大家好讨论啊。
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3楼2009-06-05 08:32:13
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wjswj

木虫 (正式写手)

小木虫领金币专业户
实时定量PCR，非反转录PCR。举例，在某生物基因组内，理论上x基因的拷贝数是y基因拷贝数的2倍，通过优化引物PCR条件等手段想在实时定量PCR上反映出x与y的关系（即x：y=2：1）。请问这种试验的理想结果出现的次数能占所作试验的总次数的多少啊？
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金币是赌出来的
4楼2009-06-05 09:17:43
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baisuilan

金虫 (正式写手)
★
wjswj(金币+1,VIP+0):谢谢了 6-8 10:55
老实说，我做RT那么多次了，每次结果都忽高忽低。但是有一点是肯定的，如果你的两个基因的确存在较大差异，还是能看出规律来的。比如我的基因用siRNA抑制之后，每次结果都是对照的20%左右，非常明显。
如果二者差异不那么大，那就难说了。可能第一次差上百倍，第二次差一两倍，第三次又成了另一个高了。
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5楼2009-06-05 10:31:49
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★
wjswj(金币+1,VIP+0):多谢多谢! 6-8 10:56
做Real-timePCR这样的结果是无法避免的，因为抽提的时候不同的人做，或者同一个人抽RNA结果都不同，再有反转录和PCR的结果没一循环如果产生某种误差那最终的结果就千差万别了，所以重复性不好是肯定的，给你推荐个技术吧，叫QGP，你可以了解一下。是做定量的新技术。不用抽提不用RT不用PCR的。
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6楼2009-06-05 13:07:07
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
wjswj(金币+1,VIP+0):谢谢：） 6-8 10:56
实验结果反复其实很大原因是条件没稳定下来
比如反转录的时候，加入的RNA的质量和浓度是否一致？
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7楼2009-06-05 16:01:52
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love_st

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by amilie030312 at 2009-6-5 13:07:
做Real-timePCR这样的结果是无法避免的，因为抽提的时候不同的人做，或者同一个人抽RNA结果都不同，再有反转录和PCR的结果没一循环如果产生某种误差那最终的结果就千差万别了，所以重复性不好是肯定的，给你推荐个 ...

介绍一下哪有这方面的资料
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8楼2009-06-05 16:17:22
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qqsvery

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by love_st at 2009-6-5 16:17:

介绍一下哪有这方面的资料

看看这个网站吧：

取代Real-time PCR的基因定量技术
http://www.ebiotrade.com/newsf/2009-10/20091014135717934.htm
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谎言和真实在河边洗澡，谎言先洗好，穿走了真实的衣服，真实却不肯穿谎言的衣服。后来人们眼里只有穿着真实衣服的谎言，却很难接受赤裸裸的真实。
9楼2010-01-22 22:43:09
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