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remax520木虫 (著名写手)
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分子生物学中应该知道的那些事儿（一）已有3人参与
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主要内容： 一、SDS-PAGE的工作原理 SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是实验室常用的基于蛋白质分子量对蛋白质进行分离的方法。 SDS-PAGE根据蛋白质的分子量来分离蛋白质，基于施加电场的作用下通过筛分基质（凝胶）产生的迁移率。 1. 使蛋白质的迁移率与分子量成正比 任何带电物种在电场中的运动都是由其净电荷、分子半径和外加电场的大小决定的。但自体折叠的蛋白质所带来的问题是，它们的净电荷和分子半径都不依赖于分子量。相反，它们的净电荷由氨基酸组成决定，即蛋白质中的氨基酸正、负电荷之和以及蛋白质三级结构的分子半径决定。 因此，在它们的原生状态下，具有相同分子量的不同蛋白质在电场中以不同的速度迁移，这取决于它们的电荷和三维形状。 为了根据分子量在电场中分离蛋白质，我们需要将蛋白质还原为线性分子，破坏三级结构，并以某种方式掩盖蛋白质的固有净电荷。这就是SDS的应用来源。 2. SDS的作用 SDS是一种存在于SDS-PAGE缓冲液中的洗涤剂，在这种缓冲液中，伴随着一点煮沸和还原剂（通常是DTT或β-ME来分解蛋白质-蛋白质二硫键），它会破坏蛋白质的三级结构。这将折叠的蛋白质转变为线性分子。 SDS利用均匀的负电荷覆盖蛋白质，从而掩盖R-基团的固有电荷。SDS与线性蛋白（约1.4g SDS/1g蛋白）的结合相当均匀，这意味着蛋白质的电荷现在与它的分子量近似成正比。 SDS也存在于凝胶中，以确保一旦蛋白质被线性化，电荷被掩盖，但蛋白质在整个电泳分离过程中仍保持这种方式（与分子量成正比的迁移）。 SDS包被的蛋白在凝胶中的迁移率的主要决定性因素是它的分子半径。 SDS包被的蛋白已被证明是线性分子，18Å宽，长度与分子量成正比，因此分子半径（它们在凝胶中的迁移率）由蛋白质的分子量决定。由于SDS包被的蛋白质具有相同的电荷质量比，因此不存在基于电荷的差异迁移。 3. 凝胶基质 在外加电场中，SDS处理后的蛋白质现在将以不同分子量产生的不同速率向阴极移动。这些不同的迁移率将被凝胶基质的高摩擦环境扩大。 SDS-PAGE的凝胶基质是聚丙烯酰胺，它具有化学惰性，并且至关重要的是可以很容易地在各种浓度下制备不同的孔径，可以产生不同的分离特性。 4. 不连续缓冲体系与浓缩凝胶 为了通过凝胶将电流从阳极传递到阴极，需要缓冲液。我们通常使用不连续Laemmli缓冲系统。 “不连续”仅仅意味着凝胶和电泳槽的缓冲液是不同的。 通常，该系统采用pH6.8的Tris-HCl缓冲液配置的浓缩胶，pH8.8的Tris-HCl缓冲液配置的分离胶以及pH8.3的电极缓冲液，浓缩胶具有低浓度的丙烯酰胺，分离胶具有更高的浓度，能够延缓蛋白质的运动。 那些不同的pH是怎么回事儿？甘氨酸可以以三种不同的电荷状态存在，正电荷、中性电荷或负电荷，这取决于pH值。用不同的缓冲液控制甘氨酸的电荷状态是整个浓缩胶的关键。 同时，这也是浓缩胶的工作原理，当电源接通时，在pH 8.3电极缓冲液中带负电荷的甘氨酸离子被迫进入浓缩胶（pH为6.8），在这种环境中，甘氨酸主要转变为两性离子（中性电荷）状态。电荷的这种损失使它们在电场中移动得非常缓慢。 另一方面，氯离子（来源于Tris-HCl）在电场中移动得很快，它们形成一个离子锋，在甘氨酸之前迁移。从Tris平衡离子（正朝阴极移动）中分离出的Cl-形成一个具有陡峭电压梯度的狭窄区，该电压梯度将甘氨酸往后拉，导致迁移离子产生两个狭长迁移前沿，高流动性的Cl-前沿，然后是较慢的中性甘氨酸前沿。 所有凝胶中的蛋白质样本的电泳迁移率处在甘氨酸和Cl-迁移率的极值之间。因此当两个前沿进入样品孔时，蛋白质浓缩到Cl-和甘氨酸之间的狭窄区。 5. 当蛋白质离开浓缩胶 浓缩胶迁移过程结束后，进入分离胶，pH转变为8.8，在该pH下，甘氨酸分子大多带负电，迁移速度比蛋白质快得多。因此，甘氨酸加速通过蛋白质，而蛋白质留在分离胶中。 结果是，蛋白质在浓缩和分离胶的界面处被浓缩到非常窄的带中，并且由于分离胶中丙烯酰胺浓度的增加，这减缓了蛋白质根据其分子量大小的运动，分离开始。 6. 浓缩胶起到了什么作用 浓缩胶胶孔约1cm深，通常需要填充足够的蛋白在凝胶上。因此，缺少浓缩胶的情况下，样本则置于分离胶上，而样本条带将达到1cm深。 与浓缩成一条带同时进入分离胶相比，没有浓缩胶意味着蛋白质在不同时间分别进入浓缩胶而形成弥散条带。 因此，浓缩胶确保蛋白质同时达到分离胶，分子量相同的蛋白质则形成紧密条带进行迁移。 7. 蛋白质分离 一旦蛋白质进入分离胶，则因高分子量蛋白质通过多孔丙烯酰胺凝胶的速度比低分子量蛋白慢而被分离。凝胶孔的大小可以根据丙烯酰胺浓度和蛋白质分子量大小而改变。 对于更宽的分离范围，或对于难以分离的蛋白质，可以使用具有丙烯酰胺浓度增加的梯度凝胶。 二、蛋白酶和蛋白酶抑制剂工作原理 1. 蛋白酶：好的，坏的，水解的 所有生物体都有蛋白水解酶和磷酸化酶，包括：你、我、甚至棉铃虫。虽然蛋白酶涉及到从宿主防御到伤口愈合乃至病毒复制的各个方面，但根据蛋白酶活性位点的构成和与目标肽键的相互作用，可以大致分为两大类。 1）通过丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸在其活性部位的亲核活化水解键； 2）天冬氨酸、谷氨酸和金属蛋白酶，利用水本身进行水解。 2. 抑制剂：你不能只靠一种 化学分解、碰撞摩擦、超声波和冻融，把整个系统都弄得乱七八糟。没有肽键是安全的！ 外肽酶攻击氨基酸链的末端，而内肽酶水解它们的内部连接。激酶磷酸化和去磷酸化随意。 没有一种抑制剂能清除所有蛋白酶，阻止每一个磷酸化事件。它需要一种“鸡尾酒”的方法来阻止蛋白质分解。蛋白酶抑制剂在胁迫下可以不可逆、可逆和可逆地作用，可以是任何小分子，如氟化钠，也可以是进化过程中自身微生物抑制剂多肽类似物。它们可以与底物竞争活性位点，有时会破坏或者囤积蛋白酶功能所需的珍贵阳离子。 竞争性抑制剂的作用是以类似底物的方式与活性位点结合通过修饰阻止蛋白酶，例如，酯化反应。许多大的竞争抑制剂通过增强亲和性和特异性结合。 竞争性的阻碍因素。因素种类繁多，从抑肽酶，一种6kDa的多肽丝氨酸蛋白酶（在极端的pH值是可逆的），到正钒酸钠，一种抑制易受骗蛋白-酪氨酸磷酸酶的小分子。 螯合剂利用它们对金属离子的增强亲和力与金属离子螯合，而不能与其他成员发生反应。金属蛋白酶的活性部位需要锌、镁、锰、钙，甚至钴来活化水，水解肽键，以达到水解目的。把锌和乙二胺四乙酸（EDTA）结合起来，把钙和乙二胺四乙酸（EGTA）结合起来，金属蛋白酶就不再有活性了。 三、琼脂糖凝胶不是通过聚合形成的 1.琼脂糖凝胶不是通过聚合形成的 聚丙烯酰胺主要用于SDS-PAGE，是由丙烯酰胺单体和双丙烯酰胺单体组成的基质。它的优点是化学惰性，因此在蛋白质通过时不会与蛋白质发生相互作用，而且它可以用不同的孔径轻松地、重复地制造出具有不同分离特性的凝胶。 聚合反应，是自由基催化的乙烯基加成反应。该反应由TEMED引发，引发过硫酸铵（APS）自由基的生成。自由基将电子转移到丙烯酰胺/双丙烯酰胺单体上，使它们呈放射状并相互作用形成聚丙烯酰胺链。 在缺失双丙烯酰胺的情况下，丙烯酰胺会聚合成长链，而不是多孔凝胶。双丙烯酰胺交联丙烯酰胺链，是形成多孔凝胶基质的原因。通过改变丙烯酰胺与双丙烯酰胺的比例，可以控制交联的量，决定凝胶的孔径和分离特性。 2. 琼脂糖凝胶形成 琼脂糖—凝胶琼脂的主要成分，可以从某些海藻中分离出来—本身就是一种聚合物。但是，聚合不是琼脂糖凝胶形成的机制。 在化学上，琼脂糖是一种多糖，其单体单元是D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳吡喃糖的二糖。 在低于35℃的水溶液中，这些聚合物链通过非共价键相互作用（像氢键）和静电相互作用被保持在多孔凝胶结构中。 加热溶液会破坏这些非共价相互作用，并使链脱离。 当溶液冷却时，这些非共价相互作用被重新建立并且形成凝胶。 所以，琼脂糖（和琼脂）凝胶是通过氢键和静电相互作用而不是通过聚合形成的。 四、乙醇是如何沉淀DNA和RNA的 乙醇沉淀法是一种在水溶液中浓缩和脱盐核酸（DNA或RNA）的常用方法。最基本的步骤是在水溶液中加入盐和乙醇，迫使核酸从溶液中沉淀出来。 通过离心分离沉淀的核酸。核酸颗粒在70%的冷乙醇中洗涤，进一步离心后，干燥去除乙醇，核酸颗粒被重新悬浮在干净的缓冲液中。 1. 关于溶解度 首先我们需要知道为什么核酸能溶于水。水是一个极性分子，由于非共享的电子对，它在氧原子附近有部分负电荷，在氢原子附近有部分正电荷。 由于这些电荷，极性分子，如DNA或RNA，可以与水分子静电作用，使它们很容易溶于水。 因此，极性分子可以被描述为亲水性分子，而非极性分子是疏水性的，它们不易与水分子相互作用。 核酸是亲水性的，这是由于糖磷酸主链上带负电荷的磷酸（PO3-）基团。 2. 盐的作用 盐在实验中的作用是中和糖磷酸骨架上的电荷。一种常用的盐是醋酸钠（乙酸钠），在溶液中，乙酸钠分解成NA+和[CH3COO]-。 带正电的钠离子中和了核酸上PO3-基团的负电荷，使分子的亲水性大大降低，因此在水中的溶解度大大降低。 3. 乙醇的作用 溶液中Na+离子与PO3-离子之间的静电吸引受库仑定律的支配，受溶液介电常数的影响。 水具有很高的介电常数，这使得Na+和PO3-很难结合在一起。 另一方面，乙醇具有较低的介电常数，使得Na+更容易与PO3-相互作用，屏蔽其电荷，使核酸不太亲水，导致其从溶液中脱落。 4. 温度的作用 低温（如-20或-80℃）下保存核酸/盐/乙醇混合物用于沉淀核酸通常在实验中认为是必要的。 然而，这不是必需的，因为浓度低至20ng/mL的核酸在0-4℃时会沉淀，因此在冰上孵育15-30分钟就足够了。 5. 70%无水乙醇洗涤步骤 把沉淀的DNA颗粒中的残留盐洗掉。 6. 关于核酸沉淀的一些建议： a. 盐的选择 使用醋酸钠（0.3M终浓度，pH值5.2）进行常规DNA沉淀； 对于含有SDS的DNA样品，使用氯化钠（终浓度为0.2M），因为NaCl使SDS在70%乙醇中保持可溶性，因此不会与DNA一起沉淀； 对于RNA，使用氯化锂（0.8M终浓度）。这是因为2.5-3体积的乙醇应用于RNA沉淀，而LiCl比NaAC更易溶于乙醇，因此不会沉淀，但要注意氯离子会抑制蛋白质合成和DNA聚合酶，因此LiCl不适合用于体外翻译或反转录RNA的制备。在这种情况下，使用NaAC。 使用乙酸铵（2M终浓度）去除dNTPs，但不用于制备应用于T4多核苷酸激酶反应的DNA，因为铵离子抑制酶活性。 提高低浓度或小核酸片段沉淀的产率（<100个核苷酸） a. 将MgCl2添加至最终浓度0.01M ； b. 将离心前在冰上孵育的时间增加到1小时。 |
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