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cathy97031

新虫 (初入文坛)

[求助] RNA能作为模板扩增出条带吗? 已有3人参与

用omega试剂盒提RNA,然后promega的DNase I消化,最后thremofisher逆转录试剂盒获得cDNA
用逆转录试剂盒中提供的GAPDH的引物(理论扩增大小为500bp左右)进行验证
模板分别用未消化的RNA、DNase I消化后的RNA 和cDNA
神奇的事情发生了:只有未消化RNA为模板扩增出500bp大小的产物,在700多的地方也有比较弱的条带;而另外两个模板都没有扩增出东西
那么问题来了:如果我的RNA 有基因组DNA污染,那么扩增出来的GAPDH大小只应该在700多bp的地方(因为该引物跨内含子),那500位置的那条带是什么?非常明显的一条带,难道是非特异扩增?或者是直接以RNA为模板获得的?
百思不得其解,担心自己样品混淆,重复了一遍,仍然是这个结果。
所以,这是为什么,向大神求解。。。
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xn8008

至尊木虫 (知名作家)

Balance Angel

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-08-27 22:22:00
你是否怀疑过引物的管子已经被污染了,你扩增的是引物里面污染的DNA片段

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2楼2019-08-27 14:53:10
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cathy97031

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by xn8008 at 2019-08-27 14:53:10
你是否怀疑过引物的管子已经被污染了,你扩增的是引物里面污染的DNA片段

应该不是引物管子的问题,因为我是配的总的PCR体系,分装以后加不同的模板P的,如果是引物管子污染,那么应该所有的PCR都有条带
但是你提到污染,让我想到,是不是我装RNA的管子污染了?但是是污染了什么呢?细菌?
虽然不知道是污染了什么,但是我的RNA就没有提出来,或者降解了,是可以确定的对吗?
3楼2019-08-27 15:06:08
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xn8008

至尊木虫 (知名作家)

Balance Angel

如果测序就能知道,如果不能,就重新做点工作液,重新提取,有你抱怨的时间,重新开始

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4楼2019-08-27 15:09:22
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cathy97031

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by xn8008 at 2019-08-27 15:09:22
如果测序就能知道,如果不能,就重新做点工作液,重新提取,有你抱怨的时间,重新开始

好吧,只是想知道什么原因导致的
5楼2019-08-27 15:14:22
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xn8008

至尊木虫 (知名作家)

Balance Angel

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-08-27 22:22:28
国内试验条件不行,水都不是纯水,很多时候都是复合物因素,没办法单独说明那个因素,你重新做,小心一些就好

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6楼2019-08-27 19:27:06
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wadecao

禁虫 (正式写手)

感谢参与,应助指数 +1
本帖内容被屏蔽

7楼2019-08-27 21:38:22
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xinxiyuzhou

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
其实我很好奇,你为什么想起来用RNA做模板扩增内参。正常情况下都是从cDNA做。所以我觉得你也不用考虑是什么原因引起的,先把你想做的做出来再说吧。
8楼2019-08-28 17:00:35
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cathy97031

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by xinxiyuzhou at 2019-08-28 17:00:35
其实我很好奇,你为什么想起来用RNA做模板扩增内参。正常情况下都是从cDNA做。所以我觉得你也不用考虑是什么原因引起的,先把你想做的做出来再说吧。

好的,谢谢你
9楼2019-08-30 13:48:15
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何超小

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

我觉得是可能是你的RNA和反转录成cDNA已经有降解了,基因序列不完整,但是你说的引物跨的内含子,有时候内含子序列太短了,也是可以扩增DNA基因组的,所以可以试试设计引物时跨外显子看看,会不会出现同样的实验结果。
10楼2019-08-31 23:09:23
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