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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » RNA能作为模板扩增出条带吗？
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cathy97031

新虫 (初入文坛)

[求助] RNA能作为模板扩增出条带吗？ 已有3人参与

用omega试剂盒提RNA，然后promega的DNase I消化，最后thremofisher逆转录试剂盒获得cDNA
用逆转录试剂盒中提供的GAPDH的引物（理论扩增大小为500bp左右）进行验证
模板分别用未消化的RNA、DNase I消化后的RNA 和cDNA
神奇的事情发生了：只有未消化RNA为模板扩增出500bp大小的产物，在700多的地方也有比较弱的条带；而另外两个模板都没有扩增出东西
那么问题来了：如果我的RNA 有基因组DNA污染，那么扩增出来的GAPDH大小只应该在700多bp的地方（因为该引物跨内含子），那500位置的那条带是什么？非常明显的一条带，难道是非特异扩增？或者是直接以RNA为模板获得的？
百思不得其解，担心自己样品混淆，重复了一遍，仍然是这个结果。
所以，这是为什么，向大神求解。。。
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1楼 2019-08-27 14:46:58
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xn8008

至尊木虫 (知名作家)

Balance Angel
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-08-27 22:22:00
你是否怀疑过引物的管子已经被污染了，你扩增的是引物里面污染的DNA片段

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2楼2019-08-27 14:53:10
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cathy97031

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xn8008 at 2019-08-27 14:53:10
你是否怀疑过引物的管子已经被污染了，你扩增的是引物里面污染的DNA片段

应该不是引物管子的问题，因为我是配的总的PCR体系，分装以后加不同的模板P的，如果是引物管子污染，那么应该所有的PCR都有条带
但是你提到污染，让我想到，是不是我装RNA的管子污染了？但是是污染了什么呢？细菌？
虽然不知道是污染了什么，但是我的RNA就没有提出来，或者降解了，是可以确定的对吗？
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3楼2019-08-27 15:06:08
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xn8008

至尊木虫 (知名作家)

Balance Angel
如果测序就能知道，如果不能，就重新做点工作液，重新提取，有你抱怨的时间，重新开始

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4楼2019-08-27 15:09:22
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cathy97031

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by xn8008 at 2019-08-27 15:09:22
如果测序就能知道，如果不能，就重新做点工作液，重新提取，有你抱怨的时间，重新开始

好吧，只是想知道什么原因导致的
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5楼2019-08-27 15:14:22
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xn8008

至尊木虫 (知名作家)

Balance Angel
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-08-27 22:22:28
国内试验条件不行，水都不是纯水，很多时候都是复合物因素，没办法单独说明那个因素，你重新做，小心一些就好

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6楼2019-08-27 19:27:06
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wadecao

禁虫 (正式写手)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
7楼2019-08-27 21:38:22
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xinxiyuzhou

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
其实我很好奇，你为什么想起来用RNA做模板扩增内参。正常情况下都是从cDNA做。所以我觉得你也不用考虑是什么原因引起的，先把你想做的做出来再说吧。
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8楼2019-08-28 17:00:35
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cathy97031

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by xinxiyuzhou at 2019-08-28 17:00:35
其实我很好奇，你为什么想起来用RNA做模板扩增内参。正常情况下都是从cDNA做。所以我觉得你也不用考虑是什么原因引起的，先把你想做的做出来再说吧。

好的，谢谢你
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9楼2019-08-30 13:48:15
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何超小

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

我觉得是可能是你的RNA和反转录成cDNA已经有降解了，基因序列不完整，但是你说的引物跨的内含子，有时候内含子序列太短了，也是可以扩增DNA基因组的，所以可以试试设计引物时跨外显子看看，会不会出现同样的实验结果。
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10楼2019-08-31 23:09:23
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