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Kao、拉拉

新虫 (初入文坛)

[求助] 融合蛋白进行酶切后,目的蛋白不流穿 已有2人参与

我的蛋白具组氨酸标签,镍柱纯化后得到的融合蛋白进行酶切,之后再上镍柱纯化想要得到我的目的蛋白,结果目的蛋白并不流穿。我也做过一些改进方法,将柱材料减少一部分之后,目的蛋白会流传下来,但是仍然有部分还在柱子里,求助各位大神们有没有什么改进的方法啊。感谢感谢

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Kao、拉拉

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by sannny at 2019-07-27 07:32:26
样品里面加5-25mM咪唑。或者用25mM咪唑进行洗脱,可以把目的蛋白洗下来。很多氨基酸都会和镍结合的,只是结合强度没有六个连续组氨酸那么强,这也是镍柱纯化通常纯度较差的原因。
...

好的,谢谢,我这样试着做一下

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3楼2019-07-27 14:05:34
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sannny

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
样品里面加5-25mM咪唑。或者用25mM咪唑进行洗脱,可以把目的蛋白洗下来。很多氨基酸都会和镍结合的,只是结合强度没有六个连续组氨酸那么强,这也是镍柱纯化通常纯度较差的原因。

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2楼2019-07-27 07:32:26
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cloveseven

银虫 (初入文坛)

楼主,您的问题解决了么?我目前也遇到同样问题,使用高于30mM的咪唑后目的蛋白和蛋白酶就都洗脱下来了

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4楼2019-10-11 22:52:23
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ECUST_CAPF

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

有没有试过on beads 酶切?直接切了接flow through
Behind the glory is a loneliness
5楼2020-03-12 14:26:31
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