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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 融合蛋白进行酶切后，目的蛋白不流穿
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Kao、拉拉

新虫 (初入文坛)

[求助] 融合蛋白进行酶切后，目的蛋白不流穿 已有2人参与

我的蛋白具组氨酸标签，镍柱纯化后得到的融合蛋白进行酶切，之后再上镍柱纯化想要得到我的目的蛋白，结果目的蛋白并不流穿。我也做过一些改进方法，将柱材料减少一部分之后，目的蛋白会流传下来，但是仍然有部分还在柱子里，求助各位大神们有没有什么改进的方法啊。感谢感谢

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1楼 2019-07-26 16:40:16
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sannny

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
样品里面加5-25mM咪唑。或者用25mM咪唑进行洗脱，可以把目的蛋白洗下来。很多氨基酸都会和镍结合的，只是结合强度没有六个连续组氨酸那么强，这也是镍柱纯化通常纯度较差的原因。

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2楼2019-07-27 07:32:26
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Kao、拉拉

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sannny at 2019-07-27 07:32:26
样品里面加5-25mM咪唑。或者用25mM咪唑进行洗脱，可以把目的蛋白洗下来。很多氨基酸都会和镍结合的，只是结合强度没有六个连续组氨酸那么强，这也是镍柱纯化通常纯度较差的原因。
...

好的，谢谢，我这样试着做一下

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3楼2019-07-27 14:05:34
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cloveseven

银虫 (初入文坛)
楼主，您的问题解决了么？我目前也遇到同样问题，使用高于30mM的咪唑后目的蛋白和蛋白酶就都洗脱下来了

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4楼2019-10-11 22:52:23
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ECUST_CAPF

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

有没有试过on beads 酶切？直接切了接flow through
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Behind the glory is a loneliness
5楼2020-03-12 14:26:31
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王仔牛奶糖

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ECUST_CAPF at 2020-03-12 14:26:31
有没有试过on beads 酶切？直接切了接flow through

您好，可以问一下 on beads 酶切具体咋做吗？
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6楼2024-01-05 10:26:53
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