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iceneo1983

银虫 (小有名气)

[交流] 请教大家一个免疫沉淀的问题

我最近在做免疫沉淀中出现了这样的现象,我用细胞裂解液作为抗原,其中含有大约2mg总蛋白,我加了5微升的多克隆抗血清作为抗体,过夜结合后,用ProteinA的珠子沉淀抗原。检测时发现没有相应的抗原被沉淀下来,电泳检测ProteinA吸附后的细胞裂解液发现其中抗原仍然存在,而且没有抗体的重链的条带,也就是说ProteinA的珠子可以吸附抗体,珠子是没有问题的。
想请教一下有经验的同学,这是不是因为我的抗体用量不够而导致没有沉淀下来目的抗原呢?
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)


iceneo1983(金币+1,VIP+0): 5-28 10:30
做IP的抗体一般都是纯化过的……
不然很可能出现很多无法预计的情况
因为WB是变性的蛋白,而IP是天然构象的
因此需要能够识别相应表抗的抗体才能做
5楼2009-05-27 19:41:13
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★
iceneo1983(金币+2,VIP+0): 5-27 19:26
请问这个抗体能否用于做IP呢?这是个很重要的问题
做IP和WB的抗体不一定是通用的
2楼2009-05-26 21:43:28
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dianaofyezi

金虫 (正式写手)

★ ★ ★
amisking(金币+1,VIP+0):回答的挺有道理,继续加油!谢谢支持! 5-27 09:29
iceneo1983(金币+2,VIP+0): 5-27 19:26
首先考虑楼上的说法,这个抗体是否能够做IP,然后再考虑抗原的问题,是不是浓度太低,分子量多大,你的抗血清是否经过纯化等问题,如果是高效价特异的抗血清,5ul是足够试验的.另外需要考虑的就是你的反应缓冲体系,该体系是否对抗原抗体的结合有影响.
52187644
3楼2009-05-27 07:39:15
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iceneo1983

银虫 (小有名气)

谢谢楼上的回复,请问一下做IP的抗体有什么特殊的要求吗?我用的就是自己提的克隆蛋白做抗原注射到兔子体内,然后取兔子的血清来做的抗体,而且没有经过纯化,不知道这个是不是符合IP抗体的要求?第一次做生物的东西,所以没有什么概念,谢谢
4楼2009-05-27 19:24:52
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