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沧海蝴蝶

[交流] 重组质粒这样正常吗?急!!

PCR产物(1kb)连到PMD18-T(2.7kb)上,蓝白斑筛选。挑了6个白色菌落,提了一下质粒。第二个孔是PMD18-T质粒,重组质粒怎么变小了?正常吗?是不是没连上?很着急。
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)


lwf991229(金币+1,VIP+0):鼓励~ 5-25 12:53
T载体是开环的,跑得慢是正常的。
第6孔估计是载体自连
其它可能是阳性克隆
2楼2009-05-24 18:42:26
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anik

银虫 (正式写手)


lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论 5-25 12:54
引用回帖:
Originally posted by 沧海蝴蝶 at 2009-5-24 18:20:
PCR产物(1kb)连到PMD18-T(2.7kb)上,蓝白斑筛选。挑了6个白色菌落,提了一下质粒。第二个孔是PMD18-T质粒,重组质粒怎么变小了?正常吗?是不是没连上?很着急。

第二个空是空载体?
有没有弄错上样顺序?酶切下看看有没有
3楼2009-05-24 18:44:14
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沧海蝴蝶

谢谢二位。没有弄错上样顺序,也切了,可切不开,所以觉得很可疑。
50μl酶切体系:
XhoⅠ                  1.5μl
NdeⅠ                  1.5μl
重组质粒              1μl
10×H Buffer          5μl
灭菌ddH2O           补足50μl
37℃过夜
4楼2009-05-24 20:28:58
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w.king124

金虫 (正式写手)


质粒怎么是两条带呢?图上是酶切过得吗
5楼2009-05-25 11:48:22
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seven5650

铜虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
切不开也可能是你酶的问题呢。做单酶切对照没?
6楼2009-05-25 13:25:57
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沧海蝴蝶

没做单酶切对照,上面的电泳图都是重组质粒,没有切。现附上酶切过的图,好像是没切开,第二个孔是重组质粒,三四孔是双酶切过的。
7楼2009-05-25 19:47:05
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charlies929

至尊木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
1. 酶切体系中质粒只加1ul太少了吧
2. 抽提出的质粒由于存在3种构象DNA电泳中大小有差异很正常。
3. 单酶切下后就可以看出实际大小了
4. 建议双酶切鉴定和质粒PCR鉴定
8楼2009-05-26 17:09:23
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)

像是切开了啊
9楼2009-05-26 18:30:07
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jqq1985

银虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
你没有做酶切吧,环状质粒比线性的Marker跑得快是正常的。
10楼2009-05-26 19:15:28
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