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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 重组质粒这样正常吗？急！!
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沧海蝴蝶

[交流] 重组质粒这样正常吗？急！!

PCR产物（1kb）连到PMD18-T（2.7kb）上，蓝白斑筛选。挑了6个白色菌落，提了一下质粒。第二个孔是PMD18-T质粒，重组质粒怎么变小了？正常吗？是不是没连上？很着急。
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1楼 2009-05-24 18:20:21
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
★
lwf991229(金币+1,VIP+0):鼓励~ 5-25 12:53
T载体是开环的，跑得慢是正常的。
第6孔估计是载体自连
其它可能是阳性克隆
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2楼2009-05-24 18:42:26
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anik

银虫 (正式写手)
★
lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论 5-25 12:54
引用回帖:
Originally posted by 沧海蝴蝶 at 2009-5-24 18:20:
PCR产物（1kb）连到PMD18-T（2.7kb）上，蓝白斑筛选。挑了6个白色菌落，提了一下质粒。第二个孔是PMD18-T质粒，重组质粒怎么变小了？正常吗？是不是没连上？很着急。

第二个空是空载体？
有没有弄错上样顺序？酶切下看看有没有
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3楼2009-05-24 18:44:14
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沧海蝴蝶

谢谢二位。没有弄错上样顺序，也切了，可切不开，所以觉得很可疑。
50μl酶切体系：
XhoⅠ                  1.5μl
NdeⅠ                  1.5μl
重组质粒              1μl
10×H Buffer          5μl
灭菌ddH2O           补足50μl
37℃过夜
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4楼2009-05-24 20:28:58
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w.king124

金虫 (正式写手)
质粒怎么是两条带呢？图上是酶切过得吗
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5楼2009-05-25 11:48:22
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seven5650

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
切不开也可能是你酶的问题呢。做单酶切对照没？
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6楼2009-05-25 13:25:57
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沧海蝴蝶

没做单酶切对照，上面的电泳图都是重组质粒，没有切。现附上酶切过的图，好像是没切开，第二个孔是重组质粒，三四孔是双酶切过的。
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7楼2009-05-25 19:47:05
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charlies929

至尊木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1. 酶切体系中质粒只加1ul太少了吧
2. 抽提出的质粒由于存在3种构象DNA电泳中大小有差异很正常。
3. 单酶切下后就可以看出实际大小了
4. 建议双酶切鉴定和质粒PCR鉴定
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8楼2009-05-26 17:09:23
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
像是切开了啊
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9楼2009-05-26 18:30:07
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jqq1985

银虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你没有做酶切吧，环状质粒比线性的Marker跑得快是正常的。
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10楼2009-05-26 19:15:28
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