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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 氨氧化细菌pcr
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wwxxxin

铜虫 (初入文坛)

[求助] 氨氧化细菌pcr 已有1人参与

氨氧化细菌用aomA1F-amoA2R总是p不出来，弥散状。已确定模板，酶，体系没有问题（同样的样品，酶，体系，Arch amoA可以扩增出来），参考过（Li-Mei Zhang 2010）的Touchdown反应程序。退火温度梯度50-60度也设置过。问题还有可能出现在哪里？
CTO189f-CTO654r（KOWALCHUK,G. A.  1997）可以做氨氧化细菌的引物吗？是否会好一些？
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1楼 2019-05-31 17:03:16
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梧桐清雨

新虫 (小有名气)
AOB_amoA一般是很容易就p出来的，是不是你找的引物的问题？

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2楼2019-05-31 22:35:59
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wwxxxin

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 梧桐清雨 at 2019-05-31 22:35:59
AOB_amoA一般是很容易就p出来的，是不是你找的引物的问题？

一点儿都p不出来，我都怀疑是不是公司引物弄错了?

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3楼2019-06-02 11:07:52
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梧桐清雨

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
小冀-: 金币+3, 鼓励回帖交流，有帮助 2019-06-03 09:12:14
我都用1F/2R的引物，很容易出带的，除非你的不是AOB，或者是γ_变形杆菌的。还有你的退火时间有没有问题

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4楼2019-06-02 22:26:52
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qx4117

银虫 (小有名气)
我们之前也是这样的情况，你可以试着延长一下退火温度。还有你所有样品的AOB都p不出来吗？引物是在哪里合成的？引物barcode的是哪个公司合提供的？如果只是个别的，可以换一对引物barcode试试。
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5楼2019-06-03 17:26:43
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kshdd

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

那就是最后一种可能：你的引物跟你的菌对不上，换引物吧
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6楼2019-06-04 10:13:55
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wwxxxin

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 梧桐清雨 at 2019-06-02 22:26:52
我都用1F/2R的引物，很容易出带的，除非你的不是AOB，或者是γ_变形杆菌的。还有你的退火时间有没有问题

样品是土壤总DNA，退火时间是30s

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7楼2019-06-05 06:56:29
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wwxxxin

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by kshdd at 2019-06-04 10:13:55
那就是最后一种可能：你的引物跟你的菌对不上，换引物吧

不会的，样品是土壤的总DNA。

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8楼2019-06-05 06:57:54
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梧桐清雨

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by wwxxxin at 2019-06-05 06:56:29
样品是土壤总DNA，退火时间是30s
...

那建议你换个公司合成引物。土壤的总DNA是非常容易p出条带的

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9楼2019-06-05 07:10:34
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kshdd

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by wwxxxin at 2019-06-05 06:57:54
不会的，样品是土壤的总DNA。
...

有可能的，我之前的样品的养殖水体也是P不出来，最后换的引物。

引物那么多，别跟它较劲，换一对海阔天空啊
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10楼2019-06-05 15:03:12
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