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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助pcr扩增
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ZUOZUOYa

金虫 (正式写手)

[交流] 求助pcr扩增

pcr扩2000bp片段，条件变性98摄氏度 30s，退火58℃ 30s，延伸72℃ 1'20''   30cycles，扩增出来条带位置不对，偏小，后来提高退火温度到60℃，pcr结果呈现弥散状态，看不到目的条带，这是为什么，怎么改进
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1楼 2019-05-22 09:37:03
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xinxiyuzhou

至尊木虫 (著名写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2019-05-22 22:20:10
位置偏小值得商榷，要看小多少，marker在不同的胶浓度下相对位置是不一样的。还有就是58跟60的退火温度并不能产生那么大的影响。2000 bp的片段还是很好做的。我觉得模板质量也需要考虑。不行的换酶试试。扩增出来的条带位置大小不对你可以试试降低退火温度，或者做梯度PCR。
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3楼2019-05-22 19:49:59
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黑暗微光

新虫 (初入文坛)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-05-22 22:19:57
用的酶不一样，那个延伸效率不一样。一般我用的2xTag酶效率是1000bp每分钟，可以试着延长延伸时间

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2楼2019-05-22 13:51:22
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山舞银蛇

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
1.条带不对，也可能是含有二级结构，可以测序验证一下；
2.没必要98℃变性；
3.换Taq、优化buffer、换引物，都可能会改善
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核酸提取与Taqman诊断
4楼2019-05-22 22:27:49
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请教各位

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by xinxiyuzhou at 2019-05-22 19:49:59
位置偏小值得商榷，要看小多少，marker在不同的胶浓度下相对位置是不一样的。还有就是58跟60的退火温度并不能产生那么大的影响。2000 bp的片段还是很好做的。我觉得模板质量也需要考虑。不行的换酶试试。扩增出来的 ...

条带位置不对可不可能是因为引物没设计好，跑出来的东西不是我想要的？

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5楼2019-05-23 10:10:44
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