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ZUOZUOYa

金虫 (正式写手)

[交流] 求助pcr扩增

pcr扩2000bp片段,条件变性98摄氏度 30s,退火58℃ 30s,延伸72℃ 1'20''   30cycles,扩增出来条带位置不对,偏小,后来提高退火温度到60℃,pcr结果呈现弥散状态,看不到目的条带,这是为什么,怎么改进
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黑暗微光

新虫 (初入文坛)

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-05-22 22:19:57
用的酶不一样,那个延伸效率不一样。一般我用的2xTag酶效率是1000bp每分钟,可以试着延长延伸时间

发自小木虫Android客户端
2楼2019-05-22 13:51:22
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xinxiyuzhou

至尊木虫 (著名写手)

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2019-05-22 22:20:10
位置偏小值得商榷,要看小多少,marker在不同的胶浓度下相对位置是不一样的。还有就是58跟60的退火温度并不能产生那么大的影响。2000 bp的片段还是很好做的。我觉得模板质量也需要考虑。不行的换酶试试。扩增出来的条带位置大小不对你可以试试降低退火温度,或者做梯度PCR。
3楼2019-05-22 19:49:59
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山舞银蛇

铁杆木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
1.条带不对,也可能是含有二级结构,可以测序验证一下;
2.没必要98℃变性;
3.换Taq、优化buffer、换引物,都可能会改善
核酸提取与Taqman诊断
4楼2019-05-22 22:27:49
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请教各位

新虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by xinxiyuzhou at 2019-05-22 19:49:59
位置偏小值得商榷,要看小多少,marker在不同的胶浓度下相对位置是不一样的。还有就是58跟60的退火温度并不能产生那么大的影响。2000 bp的片段还是很好做的。我觉得模板质量也需要考虑。不行的换酶试试。扩增出来的 ...

条带位置不对可不可能是因为引物没设计好,跑出来的东西不是我想要的?

发自小木虫Android客户端
5楼2019-05-23 10:10:44
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匿名

用户注销 (正式写手)

本帖仅楼主可见
6楼2019-05-23 12:43:17
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