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muchong5577

金虫 (正式写手)

[交流] 求助:蛋白怎么没表达

各位虫友,帮帮我!
我pcr得到目的基因,TA克隆转了TOP10,然后酶切回收目的基因,连接到pET30a,转了BL21,从kan抗性板上挑到转化子,从转化子中提质粒酶切鉴定,小片段符合我目的基因的大小(大片段为载体啦),然后就IPTG诱导表达,SDS-PAGE检查怎么没看到我的目的片段呢。
ps: 一共有五个基因,从SDS胶上看,好像有一个表达啦,其它四个都没目的带。
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shenqicc

金虫 (小有名气)


muchong5577(金币+1,VIP+0):谢谢! 5-16 20:02
这要看你要表达的蛋白的性质的吧,有可能本身就是有不同亚基的呢,BL21也不一定就都能表达的。。。
Publish OR Perish!
2楼2009-05-16 19:35:17
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)


muchong5577(金币+1,VIP+0):单独表达都没实现 ,还怎么融合表达咯. 5-16 22:09
可以考虑融合表达
3楼2009-05-16 20:17:55
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muchong5577

金虫 (正式写手)

有几个我测序了的 start code 没突变啊
4楼2009-05-16 22:14:30
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)


muchong5577(金币+1,VIP+0):谢谢 5-17 22:30
融合表达就是为了部分解决单独不能表达的
5楼2009-05-17 08:38:27
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mimisikai

金虫 (小有名气)


muchong5577(金币+1,VIP+0):谢谢 5-17 22:30
多挑几个菌试试
6楼2009-05-17 09:01:32
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大海一孤舟

铜虫 (小有名气)


muchong5577(金币+1,VIP+0):谢谢 5-17 22:30
不是每个转化好的菌都能表达的,还要有跟你要表达的基因有很大的关系的
7楼2009-05-17 13:23:59
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wuer413023

至尊木虫 (文坛精英)

没事领金币

有没有形成包涵体啊
上邪!我欲与君相知,长命无绝衰。山无陵,江水为竭,冬雷震震,夏雨雪,天地合,乃敢与君绝!
8楼2009-05-17 23:59:44
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蓝色基因

金虫 (正式写手)


muchong5577(金币+1,VIP+0):谢谢 5-18 13:00
首先,酶切是单酶切和双酶切都做了吗?有做测序鉴定没有?

你加入IPTG诱导时温度控制是多少?我们实验室控制在15-25度之间,37度诱导效果反而不好。

还有,加IPTG是OD值是多少,0.6么,这个会有一定的影响,但不是主要因素。
9楼2009-05-18 09:43:56
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yoyocan

金虫 (正式写手)

IPTG 诱导很关键! 你要多尝试几次!
10楼2009-05-18 10:34:09
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