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怎么用胰酶消化法证明膜蛋白具有方向性？放射性同位素标记法也可以证明膜蛋白具有方向性吗？ @飞约疯人院 发自小木虫Android客户端 |
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胰酶消化法 - 实验原理： - 胰蛋白酶是一种以游离Lys或Arg构成的肽键为特异性位点，将蛋白质水解为小分子肽的酶； - 膜蛋白可分为三种基本的类型：内在蛋白、外在蛋白、脂锚定膜蛋白。 - 实验步骤： - 将一组完整的细胞低渗处理，除去细胞内含物，保留细胞膜，从中提取膜蛋白后用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术分离膜上各类蛋白质，得到其条带Ⅰ； - 将一组完整的细胞放入含有等渗浓度胰酶的溶液中，使胰酶仅消化完暴露在细胞膜外表面的蛋白质。处理适当时间后，将细胞转入至不含胰酶的等渗液中清洗干净，再将细胞低渗破裂，除去细胞内含物，保留细胞膜，从中提取膜蛋白后，用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术分离膜上各类蛋白质，得到条带Ⅱ； - 将一组完整的细胞低渗裂解后用胰酶处理适当时间，洗净胰酶后，保留细胞膜，并提取膜上蛋白质，继续用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离膜上各类蛋白质得到条带Ⅲ； - 比较以上三步获得的三个条带： - 条带Ⅰ可以大致估计膜蛋白质的种类； - 条带Ⅰ与条带Ⅱ比较：条带Ⅱ中，迁移长度几乎不变的蛋白质吸附或嵌于细胞膜内表面；迁移长度明显减小的蛋白质贯穿整个膜或嵌于细胞膜外表面；条带消失的蛋白质，仅在膜外与脂分子或糖脂连接成脂锚钉的膜蛋白； - 条带Ⅲ与条带Ⅰ和条带Ⅱ比较：条带Ⅲ中，迁移长度依旧不变的蛋白质完全包被于膜内(实际几乎不存在)；条带Ⅱ中迁移长度不变，而条带Ⅲ中减小的蛋白质嵌于膜的内表面；条带消失的蛋白质仅通过弱相互作用吸附于膜内。 - 实验结论： 由上述分析的膜蛋白分布规律可知，膜蛋白在细胞膜内外表面及其上的分布状态不一样，体现了细胞膜蛋白的方向性。 —————————————————————————— —————————————————————————— 同位素标记法 - 实验原理 - 乳酸过氧化物酶能将碘标记到暴露的蛋白质Tyr残基上； - 可通过放射性标记，检测被标记了???I的蛋白质的具体位置。 - 实验步骤 - 将一组膜囊置于同时含有???I和乳酸过氧化物酶的溶液中，标记暴露在膜外的蛋白质； - 将一组膜囊在含有乳酸过氧化物酶的低渗溶液中长期培养，使乳酸过氧化物酶渗入膜囊内。将其转至含有???I的等渗溶液中，使???I进入膜囊内，标记内膜表面上的蛋白质； - 在电镜下放射性检测，观察两组样品放射性强弱分布。 - 实验结论 检测到两组样品的放射性分布不同，证明细胞膜蛋白具有方向性。 发自小木虫Android客户端 |
2楼2019-03-25 00:44:56
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4楼2019-03-25 00:53:52
