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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 大片段基因扩增求助
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yuhuimeiye

木虫 (著名写手)

[交流] 大片段基因扩增求助

要调取的目的基因比较大，有3100bp，取动物细胞和组织分别提取RNA，检测RNA质量还可以，反转录用的fermentas的酶，反应条件为室温十分钟，42度一小时，冰上两分钟。然后进行PCR，一条带都没有，我将目的基因设计了3对引物，分3段扩增，也没有结果，做嵌式都没有结果。麻烦大家帮忙分析一下原因。谢谢

[ Last edited by yuhuimeiye on 2009-5-14 at 11:38 ]
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1楼 2009-05-14 11:28:53
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hulqi

金虫 (正式写手)
你RNA质量检测可以的话，那就是反转录那一步出了问题，你反转录是用的试剂盒不？一般RNA出来了，cDNA问题不是很大的。是做RT的吗？
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6楼2009-05-15 00:31:03
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大海一孤舟

铜虫 (小有名气)
你的实验操作我不是很清楚。如果pcr什么条带都没有。
1.在pcr条件上面有问题
2.你的试剂配比有问题，这个问题我曾今遇到过的。
3.就是pcr的聚合酶没有活性了
4.引物合成的有问题，或者加入的量有问题，因为即使没有模板，在正常情况下也是有一些自连现象的。
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2楼2009-05-14 12:31:59
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yuhuimeiye

木虫 (著名写手)
PCR应该没有问题，几个实验室的同学都帮我用他们实验室的东西做了，一样的结果，也不可能是酶的问题，我换了好几批。我在想是不是反转录没有调出来那么长的cDNA
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3楼2009-05-14 13:32:01
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yuhuimeiye

木虫 (著名写手)
RNA的浓度能达到2000，OD能达到1.9左右。电泳我也看了，只是5s的比较亮。RT不是用的试剂盒。用的fermentas的，他和promega的相比哪个好点呢，谢谢
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7楼2009-05-15 07:31:06
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