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yuhuimeiye

木虫 (著名写手)

[交流] 大片段基因扩增求助

要调取的目的基因比较大,有3100bp,取动物细胞和组织分别提取RNA,检测RNA质量还可以,反转录用的fermentas的酶,反应条件为室温十分钟,42度一小时,冰上两分钟。然后进行PCR,一条带都没有,我将目的基因设计了3对引物,分3段扩增,也没有结果,做嵌式都没有结果。麻烦大家帮忙分析一下原因。谢谢

[ Last edited by yuhuimeiye on 2009-5-14 at 11:38 ]
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yuhuimeiye

木虫 (著名写手)

PCR应该没有问题,几个实验室的同学都帮我用他们实验室的东西做了,一样的结果,也不可能是酶的问题,我换了好几批。我在想是不是反转录没有调出来那么长的cDNA
3楼2009-05-14 13:32:01
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大海一孤舟

铜虫 (小有名气)

你的实验操作我不是很清楚。如果pcr什么条带都没有。
1.在pcr条件上面有问题
2.你的试剂配比有问题,这个问题我曾今遇到过的。
3.就是pcr的聚合酶没有活性了
4.引物合成的有问题,或者加入的量有问题,因为即使没有模板,在正常情况下也是有一些自连现象的。
2楼2009-05-14 12:31:59
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hulqi

金虫 (正式写手)

你RNA质量检测可以的话,那就是反转录那一步出了问题,你反转录是用的试剂盒不?一般RNA出来了,cDNA问题不是很大的。是做RT的吗?
6楼2009-05-15 00:31:03
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yuhuimeiye

木虫 (著名写手)

RNA的浓度能达到2000,OD能达到1.9左右。电泳我也看了,只是5s的比较亮。RT不是用的试剂盒。用的fermentas的,他和promega的相比哪个好点呢,谢谢
7楼2009-05-15 07:31:06
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