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骆驼和小丫头

新虫 (初入文坛)

[求助] 载体连接转化,单菌落摇不起来,求大神指点! 已有1人参与

自己做的载体连接,Pet28a先酶切以后,连接目的片段。转化至DH5α里面,涂LB平板(加卡那霉素),两天才长出来几十个小点点,大的菌落不超过10个。
挑取大的单菌落,接种至LB液体培养基里,37℃摇了一夜加一天,培养基还是澄清的。第一次做构建载体,懵逼的很,希望大神指点~

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匿名

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3楼2019-03-20 14:47:34
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匿名

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2楼2019-03-20 14:45:29
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骆驼和小丫头

新虫 (初入文坛)

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3楼: Originally posted by 立林258369 at 2019-03-20 14:47:34
建议先做菌落PCR ,再去摇菌,这样可以省很多的事,同时挑菌落务必保证是单菌落。
你应该是在做原核表达,用的his 标签

对的,我摇菌3天长出来OD值不到0.4,拿菌液破碎后为模板,做PCR,然后出现一个条带为600bp左右,也不是插入的片段长度(插入片段为510bp),正常的话用通用引物p出的条带应该为800—1000bp左右。严重怀疑载体连接失败,可是失败了怎么能长出菌呢?

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4楼2019-03-22 19:44:16
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匿名

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5楼2019-03-22 20:39:34
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