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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 发酵/表达 » 载体连接转化，单菌落摇不起来，求大神指点！
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骆驼和小丫头

新虫 (初入文坛)

[求助] 载体连接转化，单菌落摇不起来，求大神指点！ 已有1人参与

自己做的载体连接，Pet28a先酶切以后，连接目的片段。转化至DH5α里面，涂LB平板（加卡那霉素），两天才长出来几十个小点点，大的菌落不超过10个。
挑取大的单菌落，接种至LB液体培养基里，37℃摇了一夜加一天，培养基还是澄清的。第一次做构建载体，懵逼的很，希望大神指点～

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1楼 2019-03-20 14:24:47
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匿名

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2楼2019-03-20 14:45:29
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匿名

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骆驼和小丫头
3楼2019-03-20 14:47:34
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骆驼和小丫头

新虫 (初入文坛)
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3楼: Originally posted by 立林258369 at 2019-03-20 14:47:34
建议先做菌落PCR ，再去摇菌，这样可以省很多的事，同时挑菌落务必保证是单菌落。
你应该是在做原核表达，用的his 标签

对的，我摇菌3天长出来OD值不到0.4，拿菌液破碎后为模板，做PCR，然后出现一个条带为600bp左右，也不是插入的片段长度（插入片段为510bp），正常的话用通用引物p出的条带应该为800—1000bp左右。严重怀疑载体连接失败，可是失败了怎么能长出菌呢？

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4楼2019-03-22 19:44:16
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匿名

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5楼2019-03-22 20:39:34
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6楼2019-03-22 20:40:39
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