应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助关于基于pET28a的蛋白表达
111/2返回列表12下一页
查看: 697  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。

xuehu2008

铜虫 (正式写手)

[交流] 求助关于基于pET28a的蛋白表达

目的蛋白只有16kD，用的是BamHI和HindIII的酶切位点，目的片段不含起始密码子但有终止密码子。然而诱导后却在35kD左右有一明显条带，16kD左右无条带。不知怎么回事？
还有就是pET28a中的起始密码子是NcoI的ATG还是NdeI的ATG？
求高手指教
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2009-05-12 23:00:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lifefamily

起点肯定是NcoI呐，pET28a的特点就是N端带有His-tag
楼主，手里拿一份质粒图谱一看，不就很清楚了么？
赞一下 回复此楼
2楼2009-05-13 10:04:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lifefamily

另，由于两段都带有His-tag，还有thrombin位点什么的，表达出的蛋白全长应该会多出几k，就不是16k了
赞一下 回复此楼
3楼2009-05-13 10:10:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xuehu2008

铜虫 (正式写手)
可也不至于多出一倍多啊？
赞一下 回复此楼
4楼2009-05-13 10:21:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lifefamily

“诱导后却在35kD左右有一明显条带”
这条带用Ni柱能纯化出来么？
赞一下 回复此楼
5楼2009-05-13 10:26:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lifefamily

过完Ni柱后还有35kD的带，那就说明问题了……
赞一下 回复此楼
6楼2009-05-13 10:26:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

GinTonic

金虫 (小有名气)
楼主 我的是两端都有his-tag的，我的蛋白理论值在12kd左右，表达后在17kd左右，大于17kd，建议你做个western吧验证下。
赞一下 回复此楼
7楼2009-05-13 12:04:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lifefamily

★
xuehu2008(金币+1,VIP+0):谢谢 5-14 23:22
做什么western啊，用anti-his抗体？
直接过镍柱纯化一下看看不就行了么！
赞一下 回复此楼
8楼2009-05-13 12:27:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

GinTonic

金虫 (小有名气)
★
xuehu2008(金币+1,VIP+0):谢谢 5-14 23:22
怎么便宜怎么搞呗 俺们实验室的anti-his是公司赠送的 但是镍柱好似也很昂贵啊
赞一下 回复此楼
9楼2009-05-13 14:38:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lifefamily

★
xuehu2008(金币+1,VIP+0):谢谢 5-14 23:22
不是啊~~
他做蛋白表达纯化的，表达出来自然是要过Ni柱的吧？实验室里肯定是有装好的Ni柱的，直接用就是了，半天搞定。
做个western不得花一天啊……
赞一下(1人) 回复此楼
10楼2009-05-13 15:02:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 xuehu2008 的主题更新
111/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭