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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助关于基于pET28a的蛋白表达
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xuehu2008

铜虫 (正式写手)

[交流] 求助关于基于pET28a的蛋白表达

目的蛋白只有16kD，用的是BamHI和HindIII的酶切位点，目的片段不含起始密码子但有终止密码子。然而诱导后却在35kD左右有一明显条带，16kD左右无条带。不知怎么回事？
还有就是pET28a中的起始密码子是NcoI的ATG还是NdeI的ATG？
求高手指教
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1楼 2009-05-12 23:00:46
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lifefamily

起点肯定是NcoI呐，pET28a的特点就是N端带有His-tag
楼主，手里拿一份质粒图谱一看，不就很清楚了么？
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2楼2009-05-13 10:04:29
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lifefamily

另，由于两段都带有His-tag，还有thrombin位点什么的，表达出的蛋白全长应该会多出几k，就不是16k了
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3楼2009-05-13 10:10:38
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xuehu2008

铜虫 (正式写手)
可也不至于多出一倍多啊？
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4楼2009-05-13 10:21:14
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lifefamily

“诱导后却在35kD左右有一明显条带”
这条带用Ni柱能纯化出来么？
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5楼2009-05-13 10:26:08
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lifefamily

过完Ni柱后还有35kD的带，那就说明问题了……
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6楼2009-05-13 10:26:39
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GinTonic

金虫 (小有名气)
楼主 我的是两端都有his-tag的，我的蛋白理论值在12kd左右，表达后在17kd左右，大于17kd，建议你做个western吧验证下。
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7楼2009-05-13 12:04:38
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lifefamily

★
xuehu2008(金币+1,VIP+0):谢谢 5-14 23:22
做什么western啊，用anti-his抗体？
直接过镍柱纯化一下看看不就行了么！
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8楼2009-05-13 12:27:09
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GinTonic

金虫 (小有名气)
★
xuehu2008(金币+1,VIP+0):谢谢 5-14 23:22
怎么便宜怎么搞呗 俺们实验室的anti-his是公司赠送的 但是镍柱好似也很昂贵啊
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9楼2009-05-13 14:38:51
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lifefamily

★
xuehu2008(金币+1,VIP+0):谢谢 5-14 23:22
不是啊~~
他做蛋白表达纯化的，表达出来自然是要过Ni柱的吧？实验室里肯定是有装好的Ni柱的，直接用就是了，半天搞定。
做个western不得花一天啊……
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10楼2009-05-13 15:02:59
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