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【求助】关于感受态细胞的制备及转化，急助
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各位虫友帮忙来看看，我们都急死了。 最近做了3次感受态细胞，但是每一次用PUC19转化，平板上居然连一个转化子都没有，次次都是这样。 请问下42摄氏度的热激真有那么关键吗？因为我们的水浴锅实际温度可能只有41度。 还有，除了这个可能原因之外，我们排除了试剂和其他操作的原因，会不会有可能是菌种出了问题？ 各位有啥经验，能否提供些信息？若这个问题解决了，必有重金酬谢！！！ |
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我做感受态都是用北化的氯化钙0.1M的加上PIPES protocol见下 效果很好 1. 挑单斑，LB培养基37° C摇过夜； 2. 1：100转接到100mL LB培养基上，用一个灭菌的250mL的三角瓶37° C培养2 hrs，参考OD590=0.375； 3. 从此开始放冰上，将菌液放入50mL的预冷的灭菌管中，冰上放置10 min； 4. 离心机调到4° C，以3000 rpm离心7min（将brake调到0，as default）； 5. 去上清，用10mL/管冰预冷的CaCl2溶液重悬菌体。 CaCl2溶液： 100mM CaCl2 16% 甘油（丙三醇） 10mM PIPES pH=7.0母液为100mM 需灭菌（auto clave） 6. 4° C，2500rpm离心5min，brake=0； 7. 去上清，用10mL/管预冷的CaCl2溶液重悬菌体； 8. 重复6步骤； 9. 去上清，用2mL/管预冷的CaCl2溶液重悬菌体； 10. 分装到tube里（每个100μL）； 11. 液氮中1~5 s，-70° C冻存。 |
7楼2009-05-13 10:51:07
mimisikai
金虫 (小有名气)
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2楼2009-05-12 21:18:29
3楼2009-05-12 21:35:27
4楼2009-05-12 21:46:03
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