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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助】关于感受态细胞的制备及转化，急助
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spiderboy

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助】关于感受态细胞的制备及转化，急助

各位虫友帮忙来看看，我们都急死了。
    最近做了3次感受态细胞，但是每一次用PUC19转化，平板上居然连一个转化子都没有，次次都是这样。
    请问下42摄氏度的热激真有那么关键吗？因为我们的水浴锅实际温度可能只有41度。
    还有，除了这个可能原因之外，我们排除了试剂和其他操作的原因，会不会有可能是菌种出了问题？
    各位有啥经验，能否提供些信息？若这个问题解决了，必有重金酬谢！！！
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1楼 2009-05-12 21:06:18
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spiderboy

金虫 (正式写手)
回楼上的，我们试剂应该是没问题的，因为第一次做的时候，现像是正常的，但是第二次做的时候就转不出来了，百思不得其解，不清楚原因在哪里
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3楼2009-05-12 21:35:27
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mimisikai

金虫 (小有名气)
★ ★
spiderboy(金币+2,VIP+0):谢谢 5-12 21:54
41度和42度相差不大 我用52度还成功转化过

问题在你的感受态 试剂很重要 要保证一定的纯度 尤其是氯化钙 也可以尝试加点氯化镁

全程保持低温更是关键

我做出来的感受态用一年也很好
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2楼2009-05-12 21:18:29
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taizf

金虫 (小有名气)
★
spiderboy(金币+1,VIP+0):谢谢 5-12 22:33
一点经验：关键是全程冰浴和密度合适。完成后放入4摄氏度过夜，第二天加15%甘油液氮速冻，-70保存。
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4楼2009-05-12 21:46:03
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临风7071

木虫 (正式写手)
★
spiderboy(金币+1,VIP+0):谢谢。。我们用PUC19来验证，都转化 不了 5-13 08:07
你可以用你的那个载体（没有酶切过的）去转化验证一下，如果再不长，那肯定是你的菌有问题，或者你的感受态有问题。我没做过化学感受态的，做过电转化的感受态，也失败了好几次。我觉得全程一定要低温，速度要快！另外是不是抗生素浓度太高了？或者你连的DNA片段太大了，转化不进去？
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5楼2009-05-12 22:16:10
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