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spiderboy

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助】关于感受态细胞的制备及转化,急助

各位虫友帮忙来看看,我们都急死了。
    最近做了3次感受态细胞,但是每一次用PUC19转化,平板上居然连一个转化子都没有,次次都是这样。
    请问下42摄氏度的热激真有那么关键吗?因为我们的水浴锅实际温度可能只有41度。
    还有,除了这个可能原因之外,我们排除了试剂和其他操作的原因,会不会有可能是菌种出了问题?
    各位有啥经验,能否提供些信息?若这个问题解决了,必有重金酬谢!!!
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taizf

金虫 (小有名气)


spiderboy(金币+1,VIP+0):谢谢 5-12 22:33
一点经验:关键是全程冰浴和密度合适。完成后放入4摄氏度过夜,第二天加15%甘油液氮速冻,-70保存。
4楼2009-05-12 21:46:03
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mimisikai

金虫 (小有名气)

★ ★
spiderboy(金币+2,VIP+0):谢谢 5-12 21:54
41度和42度相差不大 我用52度还成功转化过

问题在你的感受态 试剂很重要 要保证一定的纯度 尤其是氯化钙 也可以尝试加点氯化镁

全程保持低温更是关键

我做出来的感受态用一年也很好
2楼2009-05-12 21:18:29
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spiderboy

金虫 (正式写手)

回楼上的,我们试剂应该是没问题的,因为第一次做的时候,现像是正常的,但是第二次做的时候就转不出来了,百思不得其解,不清楚原因在哪里
3楼2009-05-12 21:35:27
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临风7071

木虫 (正式写手)


spiderboy(金币+1,VIP+0):谢谢。。我们用PUC19来验证,都转化 不了 5-13 08:07
你可以用你的那个载体(没有酶切过的)去转化验证一下,如果再不长,那肯定是你的菌有问题,或者你的感受态有问题。我没做过化学感受态的,做过电转化的感受态,也失败了好几次。我觉得全程一定要低温,速度要快!另外是不是抗生素浓度太高了?或者你连的DNA片段太大了,转化不进去?
5楼2009-05-12 22:16:10
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