应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白破碎，纯化问题
51/1返回列表
查看: 1329  |  回复: 4
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

四叶草B-)

新虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白破碎，纯化问题

1.  200ml大肠杆菌离心弃上清后应该加多少缓冲液重悬破碎
2.  破碎功率多少合适呢，之前都是450w，25-30min，破2秒停1秒。最后液体特别清澈，沉淀特别少，是不是破得太过了？
3.  测破碎上清酶活很高，但是最近纯化发现酶浓度太低，居然只有0.0几mg/ml，我用AKATA纯化的，进样量1ml，是不是上样太少呢，最后酶活有，但是与粗酶液比差太多。
4.  之前是100ml菌液加10ml缓冲液重悬破碎，一代准备200ml加10ml试试，看看粗酶液浓度高会不会使纯化后浓度也高点
5.  重悬菌体用的Tris-HCL（PH8.0），纯化结合液用的PBS（PH7.4含少量咪唑），两个缓冲液不一致会有影响吗？
恳请大家帮忙指点一下！非常感谢！

发自小木虫Android客户端
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2019-03-05 09:10:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

暖心calmyz

银虫 (正式写手)
200ml大概10mlbuffer就够了～纯化后只有零点几的浓度说明你的蛋白根本就没有吧，是不是你的蛋白就不挂柱呢？看一下你的序列，rbs后面是否有6个His～超声的话，我们一般超2s停5s，保证菌体温度不会过高～

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
2楼2019-03-05 09:32:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

四叶草B-)

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 暖心calmyz at 2019-03-05 09:32:54
200ml大概10mlbuffer就够了～纯化后只有零点几的浓度说明你的蛋白根本就没有吧，是不是你的蛋白就不挂柱呢？看一下你的序列，rbs后面是否有6个His～超声的话，我们一般超2s停5s，保证菌体温度不会过高～
...

可是有酶活，是不是说明有目的蛋白，只是挂上去的太少或者表达得就少？。亲，重悬菌体用的缓冲液跟纯化用的不一样会影响纯化结果不？

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
3楼2019-03-05 10:12:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

暖心calmyz

银虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 四叶草B-) at 2019-03-05 10:12:56
可是有酶活，是不是说明有目的蛋白，只是挂上去的太少或者表达得就少？。亲，重悬菌体用的缓冲液跟纯化用的不一样会影响纯化结果不？
...

我们破菌用的Binding buffer，用的IDA镍柱，你那个我没用过

发自小木虫IOS客户端
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2019-03-05 11:46:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

暖心calmyz

银虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 四叶草B-) at 2019-03-05 10:12:56
可是有酶活，是不是说明有目的蛋白，只是挂上去的太少或者表达得就少？。亲，重悬菌体用的缓冲液跟纯化用的不一样会影响纯化结果不？
...

但是零点几的蛋白 就算有酶活，测得数据也不能用吧……又跑过上清和沉淀的蛋白胶吗，可能都在沉淀里吧

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
5楼2019-03-05 11:49:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 学员Jgh8z6 的主题更新
51/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 综述论文作为代表作会不会影响评审专家的印象分？ +9 yufeiwaner 2026-08-09 9/450 2026-08-10 12:25 by 流流伤
[基金申请] 我的国基提前知道中了，可是同事的操作让我实在接受不了，怎么会有这样的人 +4 家与远方 2026-08-10 6/300 2026-08-10 12:09 by 家与远方
[基金申请] 应该是93bebmhtak前后十一个字符比较关键 +12 Lanmanbaby 2026-08-09 20/1000 2026-08-10 11:51 by 要乐观耀哥
[基金申请] 面上项目filecode邪修 +5 西山十月 2026-08-09 7/350 2026-08-10 07:32 by 仁砚薪传
[基金申请] 关于代码变化问题，想知道的进来 +15 且听虎啸 2026-08-07 22/1100 2026-08-09 22:13 by 布布和一二
[基金申请] filecode与中标关系的预测 +5 布布和一二 2026-08-07 5/250 2026-08-09 16:15 by 袁向阳007
[基金申请] fileCode有新解读？ +10 Tide man 2026-08-08 18/900 2026-08-09 12:55 by 仁砚薪传
[基金申请] 关于豆爷回答的JTJC与%2F数量 +5 yang182083 2026-08-06 7/350 2026-08-08 18:29 by zhanghaozhu
[基金申请] 好奇怪的filecode +3 布布和一二 2026-08-08 4/200 2026-08-08 17:46 by zhanghaozhu
[基金申请] 关于filecode +4 布布和一二 2026-08-07 7/350 2026-08-07 22:55 by zhanghaozhu
[基金申请] 固定端突然变了，今天 +6 archvillain 2026-08-06 10/500 2026-08-07 16:03 by 医学老男孩
[基金申请] 听说今天filecode变了 +24 布布和一二 2026-08-06 47/2350 2026-08-07 16:02 by zhiyanjiang
[基金申请] filecode变化情况 +6 布布和一二 2026-08-07 22/1100 2026-08-07 14:45 by 且听虎啸
[基金申请] 大家散了吧，后缀研究没有意义，别浪费时间了，过好目前的每一天，不要焦虑 +5 Tide man 2026-08-06 7/350 2026-08-07 13:11 by 医学老男孩
[基金申请] filecode +14 等待解的谜 2026-08-06 19/950 2026-08-07 12:20 by wlwhappy
[基金申请] filecode +8 布布和一二 2026-08-06 11/550 2026-08-06 20:41 by tangpu318
[基金申请] 求各位大神看下 100+6 hpkpkpkp 2026-08-05 33/1650 2026-08-06 14:49 by zhiyanjiang
[基金申请] 影响面上的因素 +8 布布和一二 2026-08-05 11/550 2026-08-06 10:41 by 宝贝虫子
[基金申请] 8月时间戳变的，举个手。玩一下，释放压力 +9 archvillain 2026-08-04 11/550 2026-08-05 20:06 by wlwhappy
[基金申请] 有没有H口的？有收到消息的吗？ +3 超级海虾 2026-08-04 3/150 2026-08-04 17:26 by 学教育滴
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭