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四叶草B-)

新虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白破碎，纯化问题

1.  200ml大肠杆菌离心弃上清后应该加多少缓冲液重悬破碎
2.  破碎功率多少合适呢，之前都是450w，25-30min，破2秒停1秒。最后液体特别清澈，沉淀特别少，是不是破得太过了？
3.  测破碎上清酶活很高，但是最近纯化发现酶浓度太低，居然只有0.0几mg/ml，我用AKATA纯化的，进样量1ml，是不是上样太少呢，最后酶活有，但是与粗酶液比差太多。
4.  之前是100ml菌液加10ml缓冲液重悬破碎，一代准备200ml加10ml试试，看看粗酶液浓度高会不会使纯化后浓度也高点
5.  重悬菌体用的Tris-HCL（PH8.0），纯化结合液用的PBS（PH7.4含少量咪唑），两个缓冲液不一致会有影响吗？
恳请大家帮忙指点一下！非常感谢！

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1楼 2019-03-05 09:10:04
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暖心calmyz

银虫 (正式写手)
200ml大概10mlbuffer就够了～纯化后只有零点几的浓度说明你的蛋白根本就没有吧，是不是你的蛋白就不挂柱呢？看一下你的序列，rbs后面是否有6个His～超声的话，我们一般超2s停5s，保证菌体温度不会过高～

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2楼2019-03-05 09:32:54
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四叶草B-)

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 暖心calmyz at 2019-03-05 09:32:54
200ml大概10mlbuffer就够了～纯化后只有零点几的浓度说明你的蛋白根本就没有吧，是不是你的蛋白就不挂柱呢？看一下你的序列，rbs后面是否有6个His～超声的话，我们一般超2s停5s，保证菌体温度不会过高～
...

可是有酶活，是不是说明有目的蛋白，只是挂上去的太少或者表达得就少？。亲，重悬菌体用的缓冲液跟纯化用的不一样会影响纯化结果不？

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3楼2019-03-05 10:12:56
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暖心calmyz

银虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 四叶草B-) at 2019-03-05 10:12:56
可是有酶活，是不是说明有目的蛋白，只是挂上去的太少或者表达得就少？。亲，重悬菌体用的缓冲液跟纯化用的不一样会影响纯化结果不？
...

我们破菌用的Binding buffer，用的IDA镍柱，你那个我没用过

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4楼2019-03-05 11:46:59
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暖心calmyz

银虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 四叶草B-) at 2019-03-05 10:12:56
可是有酶活，是不是说明有目的蛋白，只是挂上去的太少或者表达得就少？。亲，重悬菌体用的缓冲液跟纯化用的不一样会影响纯化结果不？
...

但是零点几的蛋白 就算有酶活，测得数据也不能用吧……又跑过上清和沉淀的蛋白胶吗，可能都在沉淀里吧

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5楼2019-03-05 11:49:07
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