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293细胞转染时siRNA与Lipofectamine2000的比例
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最近开始做siRNA转染，遇到了很多问题，恳请各位转染大神帮助！ 我要转染的细胞系是转染最常用293细胞，转染体系是6孔板和6 cm皿，目的是要敲低一个分子量300多kD的蛋白质，siRNA和Lipofectamine2000均是购买而得。转染前检测了siRNA的量，确定没有降解。EP管和kit均是无RNA酶的。转染过程中使用的培养基是OPTI-MEM，种293细胞及换液用的培养基均为不含青链霉素的10%FBS的MEM培养基，293细胞汇合度为80%~90%。 根据说明书的推荐用量（75 pmol siRNA:7.5 uL Lipo2000）、做过尝试，转染6 h后换液，24 h、48 h后通过IF检测目标蛋白的表达（因为实验需要一些荧光照片，鉴于已有抗体的局限性，未对siRNA进行荧光标记），但是都没有达到转染效果。 |
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西门吹雪170: 金币+4, 鼓励回帖交流 2019-02-25 21:58:05
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| 最好在转染过程中用无血清培养基，血清会对转染效率有一定的影响。2、转染时细胞密度最好在60-80%，像我们平时使用的RFect sRNA Transfection Reagent对细胞几乎没有毒性，要求我们的细胞密度40%就可以了。如果细胞活性比较好，抗毒性比较好,试剂毒性小的时候可以降低细胞融合度，但是要注意a、细胞出于对数分裂期的时候转染效率是最好的（一般在传代后18-24h效果比较好），b、细胞凋亡后能保持一定的细胞数（收蛋白，或是RNA，细胞太少是不行的）。3、转染试剂和siRNA比例问题，这个一般在1-5：1之间，因为细胞种系等的不同，这个一般要自己摸索的，严格按照说明书做，马虎不得，特别是时间的控制也特别重要。 |
2楼2019-02-25 16:59:33