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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 大家来聊聊构建载体那些事
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星星不太萌

新虫 (小有名气)

[交流] 大家来聊聊构建载体那些事 已有5人参与

一把辛酸泪，构建一个载体两个月了，年都没回家好好过，赶回学校接着构建，以为菌落PCR结果也不错，以为就要成功了，结果酶切一直切不出片段，我用的是XhoI,3小时切和半小时一样的结果，失望了

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1楼 2019-02-23 15:03:52
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匿名

★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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2楼2019-02-23 18:49:05
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星星不太萌

新虫 (小有名气)
嗯嗯，XhoI在目的片段两端比较靠近的地方都有酶切位点

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3楼2019-02-23 22:41:32
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渊博震天

版主 (职业作家)

Yeast Display

优秀版主优秀版主
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
片段浓度要上去，实在连不起来就用无缝克隆
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4楼2019-02-24 09:02:36
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zxd95

至尊木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
单酶切后，先用碱性磷酸酶处理载体，防止自连，然后再连接。

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追梦的人
5楼2019-02-24 16:44:02
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星星不太萌

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zxd95 at 2019-02-24 16:44:02
单酶切后，先用碱性磷酸酶处理载体，防止自连，然后再连接。

具体怎么操作呢？
我先用XhoI单酶切得到了目的片段，和线性载体

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6楼2019-02-24 18:37:20
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cry_2013

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by 星星不太萌 at 2019-02-24 18:37:20
具体怎么操作呢？
我先用XhoI单酶切得到了目的片段，和线性载体
...

单酶切好像需要去磷酸化吧，要不载体容易自连，去磷酸化好像需要去磷酸化酶，需要作用时间再具体就不知道了，说明书上应该都有
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7楼2019-02-28 09:06:10
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lizimu566

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by cry_2013 at 2019-02-28 09:06:10
单酶切好像需要去磷酸化吧，要不载体容易自连，去磷酸化好像需要去磷酸化酶，需要作用时间再具体就不知道了，说明书上应该都有...

我们酶切完直接加入去磷酸37度15min
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8楼2019-02-28 10:32:35
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