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星星不太萌

新虫 (小有名气)

[交流] 大家来聊聊构建载体那些事 已有5人参与

一把辛酸泪,构建一个载体两个月了,年都没回家好好过,赶回学校接着构建,以为菌落PCR结果也不错,以为就要成功了,结果酶切一直切不出片段,我用的是XhoI,3小时切和半小时一样的结果,失望了

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匿名


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2楼2019-02-23 18:49:05
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星星不太萌

新虫 (小有名气)

嗯嗯,XhoI在目的片段两端比较靠近的地方都有酶切位点

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3楼2019-02-23 22:41:32
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渊博震天

版主 (职业作家)

Yeast Display

优秀版主优秀版主


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
片段浓度要上去,实在连不起来就用无缝克隆
4楼2019-02-24 09:02:36
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zxd95

至尊木虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
单酶切后,先用碱性磷酸酶处理载体,防止自连,然后再连接。

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追梦的人
5楼2019-02-24 16:44:02
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星星不太萌

新虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by zxd95 at 2019-02-24 16:44:02
单酶切后,先用碱性磷酸酶处理载体,防止自连,然后再连接。

具体怎么操作呢?
我先用XhoI单酶切得到了目的片段,和线性载体

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6楼2019-02-24 18:37:20
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cry_2013

木虫 (正式写手)


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引用回帖:
6楼: Originally posted by 星星不太萌 at 2019-02-24 18:37:20
具体怎么操作呢?
我先用XhoI单酶切得到了目的片段,和线性载体
...

单酶切好像需要去磷酸化吧,要不载体容易自连,去磷酸化好像需要去磷酸化酶,需要作用时间再具体就不知道了,说明书上应该都有
7楼2019-02-28 09:06:10
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lizimu566

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by cry_2013 at 2019-02-28 09:06:10
单酶切好像需要去磷酸化吧,要不载体容易自连,去磷酸化好像需要去磷酸化酶,需要作用时间再具体就不知道了,说明书上应该都有...

我们酶切完直接加入去磷酸37度15min
8楼2019-02-28 10:32:35
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