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双质粒系统的knock-in载体donorDNA区构建已有2人参与
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有没有经常做酶切连接的大神来看一看。 knockout和knockin两个载体同时在构建。 knockout是将目的基因上下游同源臂A,B通过overlap pcr连在一起，然后酶切连接到载体上。 knockin是在上述基础上在上下游同源臂A,B之间再加入一段有功能的基因，是3个片段的overlap pcr产物。 然而，两个片段的很容易就连上载体了，但是加入一段基因后，-同源臂A-基因-同源臂B- 这个片段死活连不上载体，很头疼不知道哪里出了问题。 out和in两端保护碱基都是一样的，连接的载体骨架也是一样的，酶切位点都是EcoR1和Hind3，片段双酶切过夜完胶回收然后再跑电泳条带都是大小正确且单一的。然后t4 16度连4h转化感受态。转化平板一般都不长或者长得慢挑出来验证都不是。 发自小木虫IOS客户端 |
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2楼2019-05-22 23:34:07
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首先，我很想知道你三个片段overlap产物怎么来的??问题可能就出在这里啦，你想啊，正反一对引物，恰好可以结合起来还有俩粘性末端，那三个正反正?但是你首尾是反的啊！所以要至少四条，正反正反才可以实现。不然你的三条产物就只有正反，最后一个还是反的结合不了，也就没有合适的粘性末端啦。当然也不会成功。 发自小木虫Android客户端 |
3楼2019-05-30 16:46:08