24小时热门版块排行榜    

查看: 918  |  回复: 12
当前主题已经存档。

Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] 谁做过PCR扩增质粒!

各位虫友大家好啊!小弟有个问题请教一下。我最近在用Stratagene的方法做定点突变技术:用一对带有突变位点的引物扩增整个质粒(有7kb),可是每次pcr都P不出任何条带!
    有没有做这方面的兄弟啊!大家交流一下!我的QQ:284526282
回复此楼

» 猜你喜欢

一个人可以不成功,但不可以不成长!
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xmchen1015

银虫 (小有名气)

你PCR 的片段太长了,常用的聚合酶能P到5K就不错了。
建议你再设计二条引物,在突变点附近找两个酶切位点,这两条引物跨酶切位点或在酶切位点外,再利用你的突变引物,P出两条片段,这两条片段再P成长的片段,把这个片段用那两个酶切一下,连到同样用这两个酶切的你的质粒上。

[ Last edited by xmchen1015 on 2009-5-8 at 16:12 ]
2楼2009-05-08 16:06:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)

我用的是pfu 聚合酶!
一个人可以不成功,但不可以不成长!
3楼2009-05-08 16:34:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhaocy8903

木虫 (知名作家)

7KB完全没有问题,PCR产物可直接转化
4楼2009-05-08 17:03:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xmchen1015

银虫 (小有名气)

Pfu 每分钟合成500bp,能合成3K的片段都很难吧?具体情况我也不是很清楚,没有用来P1.5K以上的片段
5楼2009-05-08 19:28:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

pph0259

木虫 (正式写手)

7kb可以扩,但pfu不适合。
6楼2009-05-08 20:55:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

elvias

铁杆木虫 (正式写手)

你可以用NEB的LA,我已经用它做了不少突变体,很好用。
7楼2009-05-09 09:12:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)

我用的是QuikChange® XL Site-Directed Mutagenesis Kit的方法做的,上面说要用pfu
一个人可以不成功,但不可以不成长!
8楼2009-05-09 10:15:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhaocy8903

木虫 (知名作家)

现在有了新版本的PFU了:FAST PFU
9楼2009-05-09 15:40:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wangqk198738

金虫 (正式写手)

那么长吗?

我还没一下p 过这么长的,不能片段P完了在连接起来吗?好运,一个质粒怎么好P呢,不会是想找一个关键片段吧,那就用不找真么麻烦了。
10楼2009-05-09 19:02:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 Anson1358 的主题更新
普通表情 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 291分工科求调剂 +3 science饿饿 2026-03-01 3/150 2026-03-01 07:49 by ms629
[考研] 272求调剂 +4 田智友 2026-02-28 4/200 2026-03-01 06:43 by 刘兵
[考研] 材料调剂 +4 爱擦汗的可乐冰 2026-02-28 4/200 2026-03-01 00:38 by 猫猫球alter
[考研] 307求调剂 +4 73372112 2026-02-28 6/300 2026-03-01 00:04 by ll247
[考研] 304求调剂 +3 52hz~~ 2026-02-28 5/250 2026-03-01 00:00 by 52hz~~
[考研] 317一志愿华南理工电气工程求调剂 +5 Soliloquy_Q 2026-02-28 8/400 2026-02-28 23:36 by xyx2012xyx
[考研] 化工专硕348,一志愿985求调剂 +4 弗格个 2026-02-28 6/300 2026-02-28 22:00 by wang_dand
[考研] 292求调剂 +3 yhk_819 2026-02-28 3/150 2026-02-28 21:57 by gaoxiaoniuma
[考博] 26申博 +4 想申博! 2026-02-26 4/200 2026-02-28 21:37 by limorning
[考研] 264求调剂 +3 巴拉巴拉根556 2026-02-28 3/150 2026-02-28 21:31 by gaoxiaoniuma
[考研] 求调剂 +4 repeatt?t 2026-02-28 4/200 2026-02-28 21:16 by gaoxiaoniuma
[考研] 高分子化学与物理调剂 +4 好好好1233 2026-02-28 7/350 2026-02-28 20:42 by 好好好1233
[考研] 085600材料工程一志愿中科大总分312求调剂 +8 吃宵夜1 2026-02-28 10/500 2026-02-28 20:27 by L135790
[考研] 298求调剂 +8 人间唯你是清欢 2026-02-28 11/550 2026-02-28 20:26 by L135790
[考博] 博士自荐 +3 kkluvs 2026-02-28 3/150 2026-02-28 16:59 by StarAura
[高分子] 求环氧树脂研发1名 +3 孙xc 2026-02-25 11/550 2026-02-28 16:57 by ichall
[考研] 265分求调剂不调专业和学校有行学上就 +4 礼堂丁真258 2026-02-28 6/300 2026-02-28 16:18 by 求调剂zz
[硕博家园] 博士自荐 +6 科研狗111 2026-02-26 9/450 2026-02-28 12:32 by seaskyy
[基金申请] 面上可以超过30页吧? +12 阿拉贡aragon 2026-02-22 13/650 2026-02-26 22:09 by Hahaxia
[硕博家园] 【博士招生】太原理工大学2026化工博士 +4 N1ce_try 2026-02-24 8/400 2026-02-26 08:40 by N1ce_try
信息提示
请填处理意见