24小时热门版块排行榜    

查看: 937  |  回复: 12
当前主题已经存档。

Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] 谁做过PCR扩增质粒!

各位虫友大家好啊!小弟有个问题请教一下。我最近在用Stratagene的方法做定点突变技术:用一对带有突变位点的引物扩增整个质粒(有7kb),可是每次pcr都P不出任何条带!
    有没有做这方面的兄弟啊!大家交流一下!我的QQ:284526282
回复此楼

» 猜你喜欢

一个人可以不成功,但不可以不成长!
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xmchen1015

银虫 (小有名气)

你PCR 的片段太长了,常用的聚合酶能P到5K就不错了。
建议你再设计二条引物,在突变点附近找两个酶切位点,这两条引物跨酶切位点或在酶切位点外,再利用你的突变引物,P出两条片段,这两条片段再P成长的片段,把这个片段用那两个酶切一下,连到同样用这两个酶切的你的质粒上。

[ Last edited by xmchen1015 on 2009-5-8 at 16:12 ]
2楼2009-05-08 16:06:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)

我用的是pfu 聚合酶!
一个人可以不成功,但不可以不成长!
3楼2009-05-08 16:34:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhaocy8903

木虫 (知名作家)

7KB完全没有问题,PCR产物可直接转化
4楼2009-05-08 17:03:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xmchen1015

银虫 (小有名气)

Pfu 每分钟合成500bp,能合成3K的片段都很难吧?具体情况我也不是很清楚,没有用来P1.5K以上的片段
5楼2009-05-08 19:28:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

pph0259

木虫 (正式写手)

7kb可以扩,但pfu不适合。
6楼2009-05-08 20:55:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

elvias

铁杆木虫 (正式写手)

你可以用NEB的LA,我已经用它做了不少突变体,很好用。
7楼2009-05-09 09:12:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)

我用的是QuikChange® XL Site-Directed Mutagenesis Kit的方法做的,上面说要用pfu
一个人可以不成功,但不可以不成长!
8楼2009-05-09 10:15:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhaocy8903

木虫 (知名作家)

现在有了新版本的PFU了:FAST PFU
9楼2009-05-09 15:40:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wangqk198738

金虫 (正式写手)

那么长吗?

我还没一下p 过这么长的,不能片段P完了在连接起来吗?好运,一个质粒怎么好P呢,不会是想找一个关键片段吧,那就用不找真么麻烦了。
10楼2009-05-09 19:02:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 Anson1358 的主题更新
普通表情 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 【2026考研调剂】制药工程 284分 求相关专业调剂名额 +4 袁奂奂 2026-03-25 8/400 2026-03-25 14:32 by lbsjt
[考研] 282求调剂 +3 wcq131415 2026-03-24 3/150 2026-03-25 12:16 by userper
[考研] 081700 调剂 267分 +10 迷人的哈哈 2026-03-23 10/500 2026-03-25 12:12 by userper
[考研] 294求调剂材料与化工专硕 +17 陌の森林 2026-03-18 17/850 2026-03-25 11:26 by greychen00
[考研] 303求调剂 +3 蓝山月 2026-03-25 3/150 2026-03-25 10:04 by 雾散后相遇lc
[考研] 化学调剂 +6 yzysaa 2026-03-21 6/300 2026-03-25 09:27 by aa331100
[考研] B区考研调剂 +4 yqdszhdap- 2026-03-22 5/250 2026-03-25 08:51 by baoball
[考研] 调剂 +4 13853210211 2026-03-24 4/200 2026-03-24 19:44 by ms629
[考研] 材料专硕找调剂 +5 哈哈哈吼吼吼哈 2026-03-23 5/250 2026-03-24 19:07 by 了了了了。。
[考研] 一志愿北京化工大学 070300 学硕 336分 求调剂 +7 vv迷 2026-03-22 7/350 2026-03-23 23:44 by Txy@872106
[考研] 291求调剂 +8 hhhhxn.. 2026-03-23 8/400 2026-03-23 23:15 by peike
[考研] 328求调剂 +4 LHHL66 2026-03-23 4/200 2026-03-23 14:55 by lbsjt
[考研] 070300,一志愿北航320求调剂 +3 Jerry0216 2026-03-22 5/250 2026-03-23 09:16 by 。。堂堂
[考研] 323求调剂 +6 洼小桶 2026-03-18 6/300 2026-03-23 00:29 by king123!
[考研] 269专硕求调剂 +6 金恩贝 2026-03-21 6/300 2026-03-22 14:31 by ColorlessPI
[考研] 297求调剂 +3 喜欢还是不甘心 2026-03-20 3/150 2026-03-21 18:33 by 学员8dgXkO
[考研] 求调剂 +6 Mqqqqqq 2026-03-19 6/300 2026-03-21 08:04 by JourneyLucky
[考研] 一志愿苏州大学材料求调剂,总分315(英一) +5 sbdksD 2026-03-19 5/250 2026-03-20 22:10 by luoyongfeng
[考研] 中南大学化学学硕337求调剂 +3 niko- 2026-03-19 6/300 2026-03-20 21:58 by luoyongfeng
[考研] 0856调剂,是学校就去 +8 sllhht 2026-03-19 9/450 2026-03-20 14:25 by 无懈可击111
信息提示
请填处理意见