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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] 谁做过PCR扩增质粒!

各位虫友大家好啊!小弟有个问题请教一下。我最近在用Stratagene的方法做定点突变技术:用一对带有突变位点的引物扩增整个质粒(有7kb),可是每次pcr都P不出任何条带!
    有没有做这方面的兄弟啊!大家交流一下!我的QQ:284526282
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xmchen1015

银虫 (小有名气)

你PCR 的片段太长了,常用的聚合酶能P到5K就不错了。
建议你再设计二条引物,在突变点附近找两个酶切位点,这两条引物跨酶切位点或在酶切位点外,再利用你的突变引物,P出两条片段,这两条片段再P成长的片段,把这个片段用那两个酶切一下,连到同样用这两个酶切的你的质粒上。

[ Last edited by xmchen1015 on 2009-5-8 at 16:12 ]
2楼2009-05-08 16:06:05
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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)

我用的是pfu 聚合酶!
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3楼2009-05-08 16:34:13
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)

7KB完全没有问题,PCR产物可直接转化
4楼2009-05-08 17:03:50
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xmchen1015

银虫 (小有名气)

Pfu 每分钟合成500bp,能合成3K的片段都很难吧?具体情况我也不是很清楚,没有用来P1.5K以上的片段
5楼2009-05-08 19:28:13
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pph0259

木虫 (正式写手)

7kb可以扩,但pfu不适合。
6楼2009-05-08 20:55:37
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)

你可以用NEB的LA,我已经用它做了不少突变体,很好用。
7楼2009-05-09 09:12:42
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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)

我用的是QuikChange® XL Site-Directed Mutagenesis Kit的方法做的,上面说要用pfu
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8楼2009-05-09 10:15:25
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)

现在有了新版本的PFU了:FAST PFU
9楼2009-05-09 15:40:20
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wangqk198738

金虫 (正式写手)

那么长吗?

我还没一下p 过这么长的,不能片段P完了在连接起来吗?好运,一个质粒怎么好P呢,不会是想找一个关键片段吧,那就用不找真么麻烦了。
10楼2009-05-09 19:02:11
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