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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 谁做过PCR扩增质粒！
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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] 谁做过PCR扩增质粒！

各位虫友大家好啊！小弟有个问题请教一下。我最近在用Stratagene的方法做定点突变技术：用一对带有突变位点的引物扩增整个质粒（有7kb），可是每次pcr都P不出任何条带！
    有没有做这方面的兄弟啊!大家交流一下！我的QQ：284526282
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一个人可以不成功，但不可以不成长！
1楼 2009-05-08 14:28:50
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xmchen1015

银虫 (小有名气)
你PCR 的片段太长了，常用的聚合酶能P到5K就不错了。
建议你再设计二条引物，在突变点附近找两个酶切位点，这两条引物跨酶切位点或在酶切位点外，再利用你的突变引物，P出两条片段，这两条片段再P成长的片段，把这个片段用那两个酶切一下，连到同样用这两个酶切的你的质粒上。

[ Last edited by xmchen1015 on 2009-5-8 at 16:12 ]
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2楼2009-05-08 16:06:05
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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)
我用的是pfu 聚合酶！
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一个人可以不成功，但不可以不成长！
3楼2009-05-08 16:34:13
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
7KB完全没有问题，PCR产物可直接转化
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4楼2009-05-08 17:03:50
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xmchen1015

银虫 (小有名气)
Pfu 每分钟合成500bp，能合成3K的片段都很难吧？具体情况我也不是很清楚，没有用来P1.5K以上的片段
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5楼2009-05-08 19:28:13
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pph0259

木虫 (正式写手)
7kb可以扩，但pfu不适合。
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6楼2009-05-08 20:55:37
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)
你可以用NEB的LA，我已经用它做了不少突变体，很好用。
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7楼2009-05-09 09:12:42
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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)
我用的是QuikChange® XL Site-Directed Mutagenesis Kit的方法做的，上面说要用pfu
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8楼2009-05-09 10:15:25
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
现在有了新版本的PFU了：FAST PFU
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9楼2009-05-09 15:40:20
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wangqk198738

金虫 (正式写手)

那么长吗？

我还没一下p 过这么长的，不能片段P完了在连接起来吗？好运，一个质粒怎么好P呢，不会是想找一个关键片段吧，那就用不找真么麻烦了。
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10楼2009-05-09 19:02:11
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