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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 表达的可溶性蛋白如何测定其活性
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xiong213

[交流] 表达的可溶性蛋白如何测定其活性

小弟最近在做原核表达，在15摄氏度诱导下表达的蛋白经过超声波破碎后电泳可以看到部分可溶性蛋白，现在想对其进行蛋白活性检测，不知道大家做过没有，给指点一下吧。急急急！谢谢各位兄弟姐妹了！
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1楼 2009-05-06 23:18:36
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hihoney

铁杆木虫 (职业作家)
都不知道表达的蛋白是什么性质，表达何用？
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2楼2009-05-07 08:23:02
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shenqicc

金虫 (小有名气)
怎么会要破碎才有可溶性蛋白？发酵液中有可溶性蛋白吗？你这种情况有可能是周质里面的，你将周质释放出来可测定蛋白活性，或者用破碎的方法，用低强度破细胞，而后测破碎上清的酶活！
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3楼2009-05-07 08:26:55
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xiong213

我这个是原核表达，原核表达的可溶性蛋白一般量比较少，大部分都是以包涵体的形式存在，现在想用破碎后的上清去测蛋白活性。
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4楼2009-05-07 08:31:54
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lifefamily

包涵体的话你换GST融合或者Trx融合表达咯
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5楼2009-05-07 08:35:17
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lifefamily

要测蛋白活性，我想到的只有通过酶和底物的特异性反应来测。
你那蛋白是一种酶么？
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6楼2009-05-07 08:36:14
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shenqicc

金虫 (小有名气)
原核表达在有的情况下，可溶性蛋白还是比较多的，这得看你用的载体是否有定位于周质或胞外的信号肽，将你表达的目的产物分泌于目的区域，这得视不同情况而定了，我们实验室目前也在做这方面课题，还牵涉到原核菌的分泌工程，而你用的是15℃培养，这种温度下菌表达的包涵体应该不多，你看看用测定蛋白活性的缓冲性破碎菌体后测定活性试试~~
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7楼2009-05-07 08:38:07
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evarain

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by hihoney at 2009-5-7 08:23:
都不知道表达的蛋白是什么性质，表达何用？

严重同意～如果是一个酶的话，只能去查文献，找方法了，试试看酶学手册上有没有你想要的？
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8楼2009-05-07 09:17:17
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GinTonic

金虫 (小有名气)
个人觉得楼主问的问题不是很清楚啊
原核表达后要首先要低温纯化获得融合蛋白，在根据标签大小，考虑是否需要切掉，不切掉的话可以直接用试剂盒测酶活的 我们这边的思路就是这样的哈
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9楼2009-05-07 13:47:54
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xiong213

测定蛋白活性的缓冲液破碎菌体后测定活性试试，不知道朋友的破碎缓冲液配方是？我是初学者所以有很多问题都不会，让兄弟姐妹们笑话了，谢谢你们提的建议，我的那个蛋白是PGIP基因在大肠杆菌的表达产物，现在我有PG酶，但是不知道怎么操作了，再说表达的产物不知道还用不用浓缩，我该怎么做呢？谢谢朋友们的热心帮助！有自己做过的或者听说过别人做过的，给个建议吧，谢谢！
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10楼2009-05-08 16:50:06
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