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Cherishqj

铜虫 (小有名气)

[求助] 反转录制备cDNA

以RNA为模板制备的cDNA是单链的,接下来要做荧光定量PCR,需要以cDNA为模板合成第二链吗?如果不需要的话那qPCR的模板就只有一条链,设计目的基因和内参基因引物的时候只设计一个引物吗?我觉得有点怪怪的,不知道我什么地方理解有问题,希望能有详细的解答,真心谢谢大家
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木元雨

木虫 (职业作家)

★ ★ ★
渊博震天: 金币+3, 鼓励回帖交流 2019-02-04 16:54:57
这个不需要合成第二链的。rna反转的cdna本来就是混合池,里面在反转的过程中已经有的第二链的存在。设计相关基因的引物的时候,是一对引物,通常都是根据相关基因的一条链设计的,另外一条之后反向互补,这一对引物也是可以扩增出来的。

发自小木虫Android客户端
2楼2019-01-31 00:36:51
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 木元雨 at 2019-01-31 00:36:51
这个不需要合成第二链的。rna反转的cdna本来就是混合池,里面在反转的过程中已经有的第二链的存在。设计相关基因的引物的时候,是一对引物,通常都是根据相关基因的一条链设计的,另外一条之后反向互补,这一对引物 ...

“里面在反转的过程中已经有的第二链的存在。”咋出来的第二链???你给解释下呗。。

个人认为不需要,因为你的primer是一对,有一条可以和第一链结合并延伸出第二链,进而后续进行正常PCR。
3楼2019-02-01 07:36:57
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木元雨

木虫 (职业作家)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 木元雨 at 2019-01-31 00:36:51
这个不需要合成第二链的。rna反转的cdna本来就是混合池,里面在反转的过程中已经有的第二链的存在。设计相关基因的引物的时候,是一对引物,通常都是根据相关基因的一条链设计的,另外一条之后反向互补,这一对引物 ...

反转过程中,已经被反转出来的单链,也会被当成模板进行下一次的反转

发自小木虫Android客户端
4楼2019-02-01 08:38:47
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 木元雨 at 2019-02-01 08:38:47
反转过程中,已经被反转出来的单链,也会被当成模板进行下一次的反转
...

一般我们用的都是MMLV和AMV,无论哪种,收拾RNA依赖的DNA聚合酶。好像都不怎么有DNA依赖的DNA聚合活性好吧。。。
5楼2019-02-06 11:43:34
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