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guoxingjun2008

金虫 (正式写手)

[交流] PCR老是P不出来??

最近做PCR,老是P不出来,不知道什么原因。用以前提的DNA是可以P出来,但是最近新提的基因组DNA就总是失败,我认为引物和酶等包括反应体系都是没有问题的,因为我后来又把以前冻存在-20°的一点DNA重新P了一次,结果是可以成功。
  总之情况就是同样的体系,用以前的DNA做模版可以P出来,而用新提取的DNA做模版却P不出来?怎么会出现这样的结果,难道是我新提取的DNA里面有杂质、蛋白或者是RNA之类的东西,又或者是DNA的浓度太高了?请高手帮我分析分析呀,谢谢!!
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wangqk198738

金虫 (正式写手)

PCR=长时间的摸索

P不出来不是问题,关键看你是不是有恒心,我也是这样,得长时间的摸索才行,要是一下下就P出来了,谁还学生物呢?根据我的经验我觉得你的好好看看引物了,引物很关键,设计的长短,一般你拿回来的引物那张表单上的Tm值相对较高了些,比如说给你的Tm是55°C,那你试试45°,有时候差距就是这么大。从低到高。一般cDNA不要太多了1微升就够了,酶是关键。新酶0.5就够了,我说的是25微升体系,不行的话试试50微升体系。希望有用!祝好!
11楼2009-05-09 18:47:11
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wangzhebasa

木虫 (著名写手)

做个模板浓度梯度看看
...................我是美丽的签名档..................Ifeelsomethinghere.Somethingtrue.
2楼2009-05-06 16:15:03
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lywinan

捐助贵宾 (职业作家)

1.可以考虑做一个模板的浓度梯度
2.利用DNA纯化试剂盒做一下纯化
3.使用管家基因如β-actin做一个PCR
4.增加引物的浓度
5.增加mg2+浓度
3楼2009-05-06 17:00:30
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j2

木虫 (正式写手)

要P 的那段是不是在质粒上啊,是的话就要考虑质粒丢失的问题
模板跑电泳看看吧,可以看看浓度问题
修炼ing,当虫仙……
4楼2009-05-07 09:55:34
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