| 查看: 1425 | 回复: 2 | ||
[求助]
细胞培养及WB实验求助
|
|
各位大神，在下细胞培养小白，可否帮在下答一下疑解一下难，以下问题在网上也都有查过，但还想在这里讨论交流一下，3Qs very much！ 一、细胞培养 我细胞培养的是hep3B，目前在6孔板里培养，想咨询一下： 1、我在网上看6孔板细胞接种量是1.2*10^6，这个量凭经验丰富的人员都不会去测的，这对于小白真的没个谱，不过通过融合度来讲，倒是可以有个宏观概念，所以，这个接种量下，细胞融合度一般会是多少（20%、30%还是50%）？ 2、传代时，网上有说融合度到80%-90%就可以了，如果收细胞体总蛋白时是不是得让融合度100%时更合适？ 3、做RNAi或药物处理时，一般细胞融合度90%时，进行消化均分实验组和对照组吗？ 这中间不需要进行细胞计数吗？ 4、细胞计数实验一般什么条件下要求做？ 二、WB实验操作 1、收的细胞用 RIPA+PMSF 提完总蛋白，在上样前加sds loading buffer的加热，只是为了让蛋白变性更充分吗？ 在加loading前就煮，会造成什么情况，煮不也是使蛋白变性吗？ 2、据我了解，有的需要加DTT或巯基乙醇，有的则不需要，什么情况下需要什么情况不需要呢？ 加DTT或巯基乙醇是跟loading一起加吗？然后再煮样 3、提完总蛋白，sds-page上样有的会用各种方法定个量，但有的实验室会直接取出几微升跑个长胶，通过考染后颜色深浅再进行上样体积的调整，这样一般 2-3次跑长胶之后的调整，就可以将颜色调成一致，之后就可进行后续的WB，这种操作是否严谨可靠？在这个研究领域是大家都认得的操作吗？ 4、WB的一抗是怎么选择，二抗是怎么选择呢？ |
回复此楼» 猜你喜欢
江苏省优青门槛
已经有20人回复
-
心好累。今年我们部门提交了18个项目。中了11了，可惜我的又挂了
已经有10人回复
-
植物学论文润色/翻译怎么收费?
已经有265人回复
-
面上项目计划书
已经有7人回复
-
面上项目计划书附件
已经有9人回复
-
面上项目计划书系统状态
已经有18人回复
-
NSFC-UNEP（与联合国环境规划署）合作项目
已经有33人回复
-
和伊朗人合作
已经有32人回复
-
江苏省自然基金
已经有8人回复
-
生命科学新英文普刊《INVESTIGATION OF LIFE SCIENCE》
已经有10人回复
2楼2019-01-13 22:44:13
 |
3楼2019-01-14 14:01:21
