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鸿鹄00000

银虫 (小有名气)

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[求助] 细胞培养及WB实验求助

各位大神，在下细胞培养小白，可否帮在下答一下疑解一下难，以下问题在网上也都有查过，但还想在这里讨论交流一下，3Qs very much！

一、细胞培养
我细胞培养的是hep3B，目前在6孔板里培养，想咨询一下：
1、我在网上看6孔板细胞接种量是1.2*10^6，这个量凭经验丰富的人员都不会去测的，这对于小白真的没个谱，不过通过融合度来讲，倒是可以有个宏观概念，所以，这个接种量下，细胞融合度一般会是多少（20%、30%还是50%）？

2、传代时，网上有说融合度到80%-90%就可以了，如果收细胞体总蛋白时是不是得让融合度100%时更合适？

3、做RNAi或药物处理时，一般细胞融合度90%时，进行消化均分实验组和对照组吗？  这中间不需要进行细胞计数吗？

4、细胞计数实验一般什么条件下要求做？

二、WB实验操作
1、收的细胞用 RIPA+PMSF 提完总蛋白，在上样前加sds loading buffer的加热，只是为了让蛋白变性更充分吗？  在加loading前就煮，会造成什么情况，煮不也是使蛋白变性吗？

2、据我了解，有的需要加DTT或巯基乙醇，有的则不需要，什么情况下需要什么情况不需要呢？加DTT或巯基乙醇是跟loading一起加吗？然后再煮样

3、提完总蛋白，sds-page上样有的会用各种方法定个量，但有的实验室会直接取出几微升跑个长胶，通过考染后颜色深浅再进行上样体积的调整，这样一般
   2-3次跑长胶之后的调整，就可以将颜色调成一致，之后就可进行后续的WB，这种操作是否严谨可靠？在这个研究领域是大家都认得的操作吗？

4、WB的一抗是怎么选择，二抗是怎么选择呢？

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