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qPCR测定质粒拷贝数
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我现在做的是双标准曲线法定量质粒的拷贝数，探针法，做标准曲线的时候遇到问题希望个为大神不吝赐教。 我们选定内参基因为16SrDNA(标准品：手提基因组）待测质粒P50（标准品：手提P50）。但是标准曲线出来，发现P50质粒标准曲线与目的基因组偏差两个数量级，即10^5浓度下，基因组CT=16.7，质粒P50 CT= 25。最终定量出来的目的质粒拷贝数为1万+。我怀疑是标准品拷贝数定量不准，但是经过多次标准品的重提及定量计算，问题依然在。请问会是什么问题产生的影响呢。提取的质粒跑胶后发现出双螺旋条带外还有一个很亮的条带，是聚体？那是不是会影响探针及引物与质粒的结合？或者是引物探针设计不合理？退火温度不合适？ 请各位大神赐教。  1 (1).jpg  1 (2).png  微信图片_20190109150723.png  微信图片_20190109153829.png@biostar2009@wizardfan |
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