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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于PCR体系的问题
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灵果Y

[交流] 关于PCR体系的问题

看到论坛上说按正常PCR配好体系后吸1微升菌液做模版
程序96℃5分钟——[95℃30秒-xx30 秒-72℃XX】——72℃10分钟-16℃
30个循环。
我看了一些PCR体系貌似也是差不多这样子的，温度或者时间也只是微调，区别不大，我想知道这选择这个体系的原因？还有打xx的地方的选择是靠什么因素决定的。第一个xx是退火温度的意思吗？请各位大虾帮我解答一下这个问题，虽然看上去有些低级。本人是新手。
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1楼 2009-05-03 21:47:45
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
呃？引物自己设计的才对退火温度才比较好摸吧……
当初设计的时候软件就给了
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5楼2009-05-03 22:07:34
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
一开始96度是在煮菌使得DNA暴露出来
94~96度都ok~
第一个xx是退火温度，根据引物来决定
第二个xx延伸时间根据片段长短和酶的扩增能力决定
一般的Taq酶是1kb/min
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2楼2009-05-03 21:50:16
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灵果Y

哦，原来是这样。but引物有的是自己设计的，怎么知道退火温度呢，还是要通过做几个重复实验来选择的？
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3楼2009-05-03 21:59:59
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)
引物设计软件可以告诉你退火温度，另一方面也可以自己简便计算一下
Tm=4*（A+T）+2*（C+G）,前提是你的引物不是特别长的那种，一般退火温度在计算出的Tm值的正负5度之内。如果你是在不放心，可以做一个pcr梯度，来确定最适温度
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4楼2009-05-03 22:03:44
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