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灵果Y

[交流] 关于PCR体系的问题

看到论坛上说按正常PCR配好体系后吸1微升菌液做模版
程序96℃5分钟——[95℃30秒-xx30 秒-72℃XX】——72℃10分钟-16℃
30个循环。
我看了一些PCR体系貌似也是差不多这样子的,温度或者时间也只是微调,区别不大,我想知道这选择这个体系的原因?还有打xx的地方的选择是靠什么因素决定的。第一个xx是退火温度的意思吗?请各位大虾帮我解答一下这个问题,虽然看上去有些低级。本人是新手。
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

一开始96度是在煮菌使得DNA暴露出来
94~96度都ok~
第一个xx是退火温度,根据引物来决定
第二个xx延伸时间根据片段长短和酶的扩增能力决定
一般的Taq酶是1kb/min
2楼2009-05-03 21:50:16
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灵果Y

哦,原来是这样。but引物有的是自己设计的,怎么知道退火温度呢,还是要通过做几个重复实验来选择的?
3楼2009-05-03 21:59:59
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)

引物设计软件可以告诉你退火温度,另一方面也可以自己简便计算一下
Tm=4*(A+T)+2*(C+G),前提是你的引物不是特别长的那种,一般退火温度在计算出的Tm值的正负5度之内。如果你是在不放心,可以做一个pcr梯度,来确定最适温度
4楼2009-05-03 22:03:44
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

呃?引物自己设计的才对退火温度才比较好摸吧……
当初设计的时候软件就给了
5楼2009-05-03 22:07:34
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灵果Y

嗯,得去学学那个设计软件。大多数用的是primer 5.0吧,我只知道这个
6楼2009-05-03 22:08:54
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)

primer 5.0就足够了,软件使用贵精不贵多
7楼2009-05-03 22:10:09
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灵果Y

晓得了,谢谢
8楼2009-05-05 00:08:27
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